RNA絶対量定量法による神経系分化過程の遺伝子発現プロファイル解析

利用RNA绝对定量法分析神经系统分化过程的基因表达谱

• 批准号: 15011236
• 负责人: 加藤 菊也
• 金额: $ 3.84万
• 依托单位: Nara Institute of Science and Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15011236/
• 关键词: ゲノム; 遺伝子; マイクロアレイ; 神経科学; 発生・分化

研究代表者は一連の遺伝子発現解析をアダプター付加競合PCR法(Adaptor-tagged competitive PCR<ATAC-PCR)で行っているが、この方法は相対発現量を測定する方法であるため、絶対量定量のための技術改良を行った。測定したい遺伝子の3'端断片の部分配列にpoly(A)を付加した合成DNAをつくる。この合成DNAについて2重鎖DNAへの変換、制限酵素切断、アダプター付加というATAC-PCRの反応過程を模擬的に行うことにより内部標準を作成する。この内部標準で滴定する事により遺伝子発現量の絶対量を測定することが可能になった。PC12は神経成長因子などの投与で神経繊維を伸張し、神経細胞に分化するが、そのプロセスの遺伝子発現プロファイル解析を相対量発現定量で行った。神経成長因子添加後1時間から14日までの間の9ポイントについて、RNAを精製、約1800個の遺伝子の発現量を測定した。絶対量定量については、96遺伝子について、神経成長因子添加前の細胞について行った。発現量は大きく異なり、1細胞あたりの発現分子数として、0.01から13,000で、その差は10^6に達した。発現量の多い遺伝子としては、cyclin D2,c-Jun,k-rasなどの増殖関係の遺伝子や、alpha4-integrinやEpthelial cadherinのなどの接着分子が目立った。発現量が極めて少ない遺伝子、即ち一部の細胞でしか発現していない遺伝子としては、inteleukin 3,6,imuhoglobulin heavy-chain binding proteinなどの免疫系の遺伝子が目立つほか、caspase 8,P-cadherinなどの遺伝子があった。遺伝子発現量の絶対量定量を続行して、測定量と遺伝子機能との関連性を探ることにしている。

Research representatives are working to improve the technique for detecting the presence of a sequence of DNA fragments by Adaptor-tagged Competitive PCR (ATAC-PCR), and for determining the relative presence of DNA fragments by this method. To determine the partial alignment of the 3'end fragment of the DNA fragment, poly(A) was added to the synthetic DNA. The synthesis of DNA involves the creation of 2-fold locked DNA conversion, restriction enzyme cleavage, ATAC-PCR reverse reaction processes, simulation, and internal standards. This internal standard is titrated to determine the amount of emission and the amount of absolute emission. PC12 quantifies the expression of growth factors in the brain, the differentiation of brain cells, and the expression of genes in the brain. After adding NGF for 1 day and 14 days, the amount of RNA extracted from 9 different DNA fragments was measured. Quantitative analysis, 96 gene analysis, cell analysis before growth factor addition The number of molecules found in one cell is 0.01 and 13,000 respectively, and the difference is 10^6 The development of a large number of genes, cyclin D2,c-Jun,k-ras, and reproductive relationships between genes, alpha4-integrin, and Epthalial cadherin, and subsequent molecules, is now under consideration. The amount of protein detected is extremely low, i.e., all cells are detected, inteleukin 3,6,imuhoglobulin heavy-chain binding protein is detected, caspase 8,P-cadherin is detected. The quantitative analysis of gene expression and gene function is carried out, and the quantitative analysis is carried out.