新たな遺伝子クローニングシステムNACSを応用した疾患遺伝子の同定

使用新基因克隆系统 NACS 鉴定疾病基因

基本信息

批准号：
15012208
负责人：
荒瀬尚
金额：
$ 3.78万
依托单位：
Chiba University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

私どもは、新たな機能的遺伝子クローニングシステムとしてNACS法(NFAT Activating Molecule Cloning System)を開発した.本研究では、NACS法の応用法を開発することによって、新たな細胞活性化機構、細胞分化機構の解明を目指し、それを基にヒト疾患遺伝子を明らかにすることを目的とし、今年度より本研究班で研究を始めた。NACS法では、ランダムプライマーで作成したcDNAライブラリーとCD8分子の細胞外領域とのキメラが作られるライブラリーを作製することになるため、cDNAライブラリーの質が、決定的に重要である。そこで、本年度ではまず、cDNAライブラリーの質を高めるために、cDNAの合成条件を検討した。今までのライブラリーでは、cDNAの合成長が長過ぎるために、翻訳開始点より上流からCD8とのキメラになっているクローンが多く、そのために、目的の遺伝子がクローニングできない欠点が認められた。そこで、cDNA合成の際に、ランダムプライマーの濃度を通常の50倍程度にすることにより、比較的小さいサイズのCD8キメラライブラリーを作成することに成功した。実際、新たに作成したライブラリーでスクリーニングすることにより、今までにクローニングできなかったCD3ζ等の既知のITAMを有する分子のほか、新たな4回膜貫通型の活性化制御分子をクローニングすることに成功した。そこで、本研究では、今回確立した、ライブラリー作成方法を基に、さらに、他の組織のライブラリーの作成を進めるほか、エストロジェンレセプターとのキメラライブラリーを作成することにより、転写因子等の新たな、リンパ球活性化制御分子のクローニング方法の確率を目指す。

我们已经开发了NACS（NFAT激活分子克隆系统）作为一种新的功能基因克隆系统。本研究小组于今年开始研究，目的是通过开发NACS方法的应用来阐明新的细胞激活和细胞分化机制，并以这种研究小组阐明了基于此方法的人类疾病基因的目的，我们已经开始研究了该方法研究小组。在NACS方法中，创建了一个库，其中创建了带有随机引物和CD8分子的细胞外区域的cDNA库之间的嵌合体，并且cDNA库的质量至关重要。因此，今年，我们首先检查了cDNA合成以改善cDNA文库质量的条件。在以前的库中，cDNA的生长太长，许多克隆具有嵌合字符，带有CD8上游的CD8开始点，因此，已经观察到无法克隆目标基因的缺点。因此，当执行cDNA合成时，随机引物的浓度降低至正常水平的50倍，并且成功创建了相对较小的CD8嵌合文库。实际上，通过使用新创建的库进行筛选，我们已经成功克隆了一种新的四跨膜类型的激活控制分子，除了具有已知ITAM（例如CD3ζ）的分子外，到目前为止尚未克隆。因此，在这项研究中，我们将根据这次建立的基于库的创建方法以及用雌激素受体创建嵌合文库来进一步开发其他组织的文库，我们旨在实现克隆新的淋巴细胞激活控制分子（如转录因子）的可能性。