ゲノム修復型遺伝子治療を指向した、機能性DNAドラッグのデザインと創製

设计和创造针对基因组修复基因治疗的功能性DNA药物

基本信息

批准号：
15012218
负责人：
清尾康志
金额：
$ 2.24万
依托单位：
Tokyo Institute of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

オリゴDNAを用いた遺伝子改変は、新しい遺伝子治療や遺伝子操作の技術として、注目されている。しかし、現段階では、その効率が非常に低いため、実用化にはいたっていない。本起案研究では、オリゴDNAを用いた遺伝子修復のなかでも、生体内のミスマッチ修復機構を利用した遺伝子修復に着目し、この二本鎖DNAに対する優れたストランドインベージョン能と、強力なミスマッチ塩基対形成能を有する人工DNAの創製を計画した。具体的には、高いインベージョン能を有することが期待される新規ペプチド核酸(PNA)のドラッグデザインと、起案者がすでに報告した、高いミスマッチ塩基対を有するN-アルコキシカルボニルシトシン(Roc-dC)とその誘導体の開発を行う。これまでに起案者が独自に開発したアルコキシカルボニルシトシン(Roc-dC)のミスマッチ塩基対形成能を高めるべく、そのコンホメーションを環状構造でロックした新規ヌクレオベースHPPのデザインと合成を行った。新規ヌクレオベースHPPを化学的にDNA中に導入し、そのワトソンクリック塩基対形成能、およびミスマッチ塩基対形成能をUV-融解曲線を用いて評価した。その結果、HPPが予想通り、高いワトソンクリック塩基対形成能とともに、強力なミスマッチ塩基対形成能を有していることが分った。HPPとAとのミスマッチ塩基対を含む二本鎖DNA30量体を化学合成し、ミスマッチ結合タンパクである高度好熱菌由来MutSとの結合実験を行った。その結果HPPは天然型A-Cミスマッチ塩基対と同等の効率でMutSに認識されることが分った。合成したHPPの分光学的性質を詳細に検討したところ、HPPは比較的強い蛍光発光を示すことがわかった。またその蛍光発光は二本鎖DNA中でグアニンと対合すると消失し、アデニンと対合すると発光することが分った。

使用Oligo DNA的遗传修饰正在吸引人们作为基因治疗和遗传操作的新技术。但是，在此阶段，它的效率极低，尚不可用于实际使用。在这项起草研究中，我们使用寡核DNA使用不匹配的修复机制在体内专注于遗传修复，并计划创建具有极好的链浸入能力的人工DNA，可用于双链DNA和强大的不匹配基碱配对能力。具体而言，我们将设计新型肽核酸（PNA）的药物，这些药物有望具有较高的浸润能力，并开发N-烷氧基氧基甲霉素（ROC-DC）及其衍生物，这些衍生物已由造物报道。迄今为止，为了增强烷氧基钙环胞嘧啶（ROC-DC）的不匹配的碱基配对能力，创建者已经开发了自己独特的碱基配对，我们设计并合成了一种基于核的HPP，其构型锁定了圆形结构。将新型的基于核的HPP化学引入DNA中，并使用UV-MELT曲线评估了Watson Crick Base配对能力，并评估了不匹配的基础配对能力。不出所料，HPP具有较高的Watson Crick底搭配能力以及强大的不匹配基础配对能力。对HPP和A之间包含不匹配的碱基对的双链DNA30Mer化学合成，并用源自高度嗜热细菌（一种不匹配的结合蛋白）的MUT进行结合实验。结果表明，HPP由与天然A-C不匹配的基本对具有相等效率的MUT识别。合成HPP的光谱特性的详细检查表明，HPP表现出相对较强的荧光发射。还发现，与鸟嘌呤在双链DNA中配对时，荧光消失，并与腺嘌呤配对时发出光。