腎臓における新しい細胞間情報伝達蛋白質のクローニング-シグナルシークエンストラップ法を用いて-

肾脏中新的细胞间信号蛋白的克隆 - 使用信号序列带方法 -

• 批准号: 08877174
• 负责人: 中尾 一和
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 1996
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08877174/
• 关键词: 腎臓; シグナルシークエンストラップ法; カテプシン; マウス; 細胞間情報伝達物質; アスパルティックプロテアーゼ

1.シグナルシークエンストラップ(SST)法によるマウス腎臓cDNAライブラリーのスクリーニング:8週齢雄性BALB/cマウス腎臓より抽出したmRNAから2本鎖cDNAを合成し、シグナルシークエンス部分を欠失させたIL-2受容体α鎖(Tac)cDNAの5'側に連結した。これをプラスミドベクターpcDL-SRαを用いてCOS-7細胞に発現させたところ、シグナルシークエンスが挿入された場合にのみ、融合蛋白質が細胞膜表面に到達し、抗Tac抗体による蛍光染色にて認識された。5000クローンをスクリーニングすることにより、25個の陽性クローンが得られた。塩基配列を決定した結果、このうち13個は既知蛋白質として、分泌蛋白質(ウログアニリン)、膜結合型受容体(シグナルシークエンス受容体)、接着分子(Kspカドヘリン)、チャンネル(アクアポリン2)、トランスポーター(Na依存症リン酸トランスポーター)が得られた。以上より、腎臓に発現する分泌型及び膜結合型蛋白質のクローニング法としてのSST法の有用性が証明された。2.新しい腎臓由来アスパルティックプロテアーゼ様蛋白質のクローニング:SST法にてマウス腎臓より得られた67アミノ酸からなる未知のポリペプチド断片をコードするクローン(E3A5)の塩基配列をもとに3'RACEを施行し、1.2kbの単一バンドを得た。cDNA全長の塩基配列の構造決定により、419アミノ酸からなるアスパルティックプロテアーゼ様蛋白質であることが明らかとなった。本蛋白質はカテプシンD、カテプシンE、レニンと47%、46%、42%の相同性を有していた。ノーザンプロット解析によりmRNAは、サイズが1.6kbで、腎臓に最も高濃度に発現しており、肺、脾臓、脂肪組織にも検出された。In situハイブリダイゼーション法により、その腎内局在を検討したところ、近位直尿細管に限局した強い遺伝子発現を認め、近位曲尿細管にも弱い発現を認めた。本プロテアーゼ様蛋白質の腎臓における遺伝子発現は近位尿細管に特異的であり、再吸収された蛋白質をライソゾーム内で分解する新しいカテプシンと考えられた。

1. The 5'-side linkage of IL-2 receptor alpha lock (Tac)cDNA was missing from the SST method. The fusion protein was detected in COS-7 cells by light staining with anti-Tac antibody. 5000 pieces of paper, 25 pieces of paper As a result, 13 known proteins, secreted proteins, membrane-bound receptors, binding molecules, and Na-dependent acid receptors were identified. The usefulness of the SST method for the detection of secreted and membrane-bound proteins in kidney tissues was demonstrated. 2. The new protein sequence:SST method was used to obtain the protein sequence of 67 amino acids. The protein sequence of E3A5 was determined by 3'RACE and 1.2 kb. The structure of the full-length cDNA base determines the protein content. The protein has the identity of 47%, 46% and 42% respectively. The highest concentration of mRNA was found in the kidney, lung, spleen and subcutaneous fat. In situ The protein in the kidney was found to be specific to the proximal urinary tubule, and the protein was reabsorbed into the kidney.

项目成果

K.Takaya et al.: "Nonsense mutation of leptin receptor in the obese spontaneously hypertensive Koletsky rat." Nature Genet.14. 130-131 (1996)

K.Takaya 等人：“肥胖自发性高血压 Koletsky 大鼠瘦素受体的无义突变。”

M.Kotani et al.: "Structural organization of the human prostaglandin EP3 receptor subtype gene." Genomics. (発表予定). (1997)

M.Kotani 等人：“人类前列腺素 EP3 受体亚型基因的结构组织”（即将出版）。

K.Mori et al.: "Gene expression of the human prostaglandin E receptor EP4 subtype:Differential regulations in monocytoid and lymphoid lineage cells by phorbol ester." J.Mol.Med.74. 333-336 (1996)

K.Mori 等人：“人前列腺素 E 受体 EP4 亚型的基因表达：佛波酯对单核细胞和淋巴谱系细胞的差异调节。”

K.Mori et al.: "Molecular cloning of a novel mouse aspartic protease-like protein that is expressed abundantly in the kidney." FEBS Lett.401. 218-222 (1997)

K.Mori 等人：“一种新型小鼠天冬氨酸蛋白酶样蛋白的分子克隆，该蛋白在肾脏中大量表达。”

T.Okazaki et al.: "Genomic organization,expression,and chromosomal mapping of the mouse adrenomedullin gene." Genomics. 37. 395-399 (1996)

T.Okazaki 等人：“小鼠肾上腺髓质素基因的基因组组织、表达和染色体作图。”