胚性腫瘍細胞の基質への接着に関与する細胞膜糖タンパク質のCDNAクローニング

参与胚胎肿瘤细胞与基质粘附的细胞膜糖蛋白的 cDNA 克隆

• 批准号: 61015086
• 负责人: 小澤 政之
• 金额: $ 2.43万
• 依托单位: Kagoshima University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Cancer Research
• 财政年份: 1986
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1986 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-61015086/
• 关键词: 胚付腫瘍細胞; 細胞接着; 細胞接着分子; 種タンパク質; CDNAクローン; 細胞外マトリックス

テラトカルシノーマOTT6050の胚様体よりpoly【(A)^+】RNAと単離し、これより合成したCDNAを発現ベクターλgtllに組み込んでCDNAライブラリーを作製した。一本CDNAライブラリーを、胚性腫瘍細胞の基質への接着に関与している糖タンパク質(GP-104)に対するアフィニティー精製抗体でスクリーニングを行ない、4つの陽性クローン(λΟ1,λΟ9,λΟ24,λΟ32)を得た。得られたλファージクローンを大腸菌に溶源化し、大量の融合タンパク質を調製した。融合タンパク質をリガンドとして、抗GP-104抗血清より融合タンパク質と特異的に反応する抗体を精製し、この抗体が細胞のいかなる成分と反応するかをWestern blottingにより調べたところ、GP-104とのみ反応した。したがって、得られたクローンはGP-104のCDNAクローンであると考えられる。これらのクローンは、それぞれ、1.48kb,1.28kb,1.33kb,1.18kbのインサートを持っているが、制限酵素のBamHI,PstI,XhaIで1ケ所切断され、EcoRIとxhaIの切断断片以外は、全く同じ大きさで、λO32のCDNAをプロープとして検索した場合に、クロスハイブリダイゼイションを示し、同一のクローンであることが判明した。これらのCDNAをM13ファージもしくはpUCプラスミドにサブクローニングしてその塩基配列の一部もしくは全部を決定した。全塩基配列を決定したλΟ9のCDNAは、534bpのオープンリーディングフレームを持ち、その3´側にはpoly(A)付加シグナルAATATA並びに15個のAが結合していた。534個の塩基配列より推定されたアミノ酸配列には、N-グリユミレーション部位のアミノ酸配列Asm-X-Ser(Thr)や膜を貫通するのに十分な大きさの疎水性アミノ酸のクラスター等は見い出されず、得られたCDNAクローは、GP-104の細胞質側のペプチド部分を規定していると考えられる。現在、GP-104の全アミノ酸配列を推定すべく、5´側部分を含むCDNAクローンの単離を行なっている。

テ ラ ト カ ル シ ノ ー マ OTT6050 の embryo others body よ り poly real RNA (A) ^ + 】 【 と 単 し, こ れ よ り synthetic し た CDNA を 発 now ベ ク タ ー lambda GTLL に group み 込 ん で CDNA ラ イ ブ ラ リ ー を cropping し た. A CDNA ラ イ ブ ラ リ ー を cells, embryo sex is swollen sores の matrix へ の then に masato and し て い る sugar タ ン パ ク mass (GP - 104) に す seaborne る ア フ ィ ニ テ ィ ー refined antibody で ス ク リ ー ニ ン グ を line な い, 4 つ の positive ク ロ ー ン (lambda Ο 1, lambda Ο 9, lambda Ο 24, 32) lambda Ο を た. Have ら れ た lambda フ ァ ー ジ ク ロ ー ン を coliform に lysogenic し, a large number of の fusion タ ン パ ク qualitative を modulation し た. Fusion タ ン パ ク qualitative を リ ガ ン ド と し て, GP - 104 antiserum よ り fusion タ ン パ ク qualitative と specific に anti 応 す る antibody を refined し, こ の antibody が cells の い か な る composition と anti 応 す る か を Western blotting に よ り adjustable べ た と こ ろ, GP - 104 と の み anti 応 し た. Youdaoplaceholder0 たがって obtained られた られた ロ ロ ロ <s:1> <s:1> られた られた えられる であると <s:1> たがって GP-104 CDNA ロ ロ であると であると であると であると to examine えられる. こ れ ら の ク ロ ー ン は, そ れ ぞ れ, 1.48 KB, 1.28 KB of 1.33 KB of 1.18 KB の イ ン サ ー ト を hold っ て い る が limitations, enzyme の BamHI, PstI and XhaI で 1 ケ cut さ れ, EcoRI と XhaI の cut off outside は fragment, all く じ big き さ で, lambda O32 の CD NA を プ ロ ー プ と し て 検 cable し た に, ク ロ ス ハ イ ブ リ ダ イ ゼ イ シ ョ ン を し, same の ク ロ ー ン で あ る こ と が.at し た. こ れ ら の CDNA を M13 フ ァ ー ジ も し く は pUC プ ラ ス ミ ド に サ ブ ク ロ ー ニ ン グ し て そ の salt base with column の a も し く は を decided all し た. Salt base full column を decided し た lambda Ο 9 の CDNA は, 534 bp の オ ー プ ン リ ー デ ィ ン グ フ レ ー ム を hold ち, そ の 3 ´ side に は poly real (A) plus シ グ ナ ル AATATA and び に 15 の A が combining し て い た. 534 の salt column base with よ り presumption さ れ た ア ミ ノ acid with column に は, N - グ リ ユ ミ レ ー シ ョ ン parts の ア ミ ノ acid with column Asm - X - Ser (Thr) を や membrane penetration す る の に very big な き さ の 疎 water-based ア ミ ノ acid の ク ラ ス タ ー etc は see い さ れ ず, ら れ た CDNA ク ロ ー は の cytoplasm, GP - 104 The <s:1> ペプチド section を stipulates that て て ると ると should be tested for えられる. Now, the GP - 104 の ア ミ ノ acid with column を presumption す べ く, part 5 ´ side を む CDNA ク ロ ー ン の 単 line from を な っ て い る.

项目成果

Kamaba,Y.;Arita,Y.;Ogata,S.;Muramatsu,H.;Muramatsu,T.: Eur.J.Biochem.(1987)

Kamaba,Y.；Arita,Y.；Ogata,S.；Muramatsu,H.；Muramatsu,T.：Eur.J.Biochem.(1987)

Nomoto,S.;Muramatsu,H.;Ozawa,M.;Suganuma,T.;Tashiro,M.;Muramatsu,T.: Exp.Cell Res.164. 49-62 (1986)

野本，S.；村松，H.；小泽，M.；菅沼，T.；田代，M.；村松，T.：Exp.Cell Res.164。

小澤政之,野口武彦,村松喬 編: "表層抗原研究法,(マウスのテラトーマ)" 理工学社, 13 (1987)

Masayuki Ozawa、Takehiko Noguchi、Takashi Muramatsu（编辑）：“表面抗原研究方法，（小鼠畸胎瘤）” Rikogakusha，13（1987）

Ozawa,M.;Yonezawa,s.;Sato,M.;Uehara,H.;Sato,E.;Muramatsu,T.: Develop.Growth Differ.(1987)

小泽，M.；米泽，s.；佐藤，M.；上原，H.；佐藤，E.；村松，T.：发展。增长差异。（1987）

小澤政之: 細胞. 19. 41-46 (1987)

小泽正之：细胞。19. 41-46 (1987)