肝細胞増殖制御因子の生物工学的技法による同定,遺伝子構造解析と大量生産のシステム化

利用生物工程技术鉴定肝细胞增殖调节因子、基因结构分析以及系统化量产

• 批准号: 01870014
• 负责人: 市原 明
• 金额: $ 8.83万
• 依托单位: The University of Tokushima
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Developmental Scientific Research (B)
• 财政年份: 1989
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1989 至 1991
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-01870014/
• 关键词: 肝細胞; 増殖制御因子; 発現ベクタ-; 細胞工学; ヒト単球; マイクロインジェクション; 卵母細胞; 肝細胞の初代培養; ツメガエル卵の発現系; 遺伝子操作; 生物工学

昨年度は当該研究プロジェクトの基礎研究としてアフリカツメガエル卵母細胞の発現系の開発と初代培養肝細胞の新しい応答系の確立を行った結果、非肝実質細胞が肝細胞の増殖制御に重要な役割を果たしていることが判明した。そこで本年度は、ヒト単球(マクロファ-ジ)が産生する種々の因子群の検討を生物工学的方法で行った。1.活性化単球に特異的なcDNAライブラリ-の作成。ヒト末梢血から単球を大量に分離精製し、エンドトキシンであるリポポリサッカライド(LPS)で刺激培養した。LPS無刺激ヒト単球から調製したpoly(A)^+mRNAより、LPS(-)cDNAライブラリ-を作成し、LPS(+)cDNAライブラリ-間で差引きハイブリダイゼ-ションを行い、LPS刺激で発現される特異的なcDNAライブラリ-を得た。2.In vitroでのmRNAの合成。上記で作製した差引きcDNAライブラリ-からT3RNAポリメラ-ゼによりin vitroでmRNAを合成した。合成したmRNAの検定はインタ-ロイキンー1及びー6をプロ-ブとしたノザンブロット法で行い、それらが単球から分離したmRNAのサイズとほぼ同じであったことから合成されたmRNAが完全鎖であることが判明した。3.マイクロインジェクションによる生物活性の検討。合成したmRNAをアフリカツメガエル卵母細胞に注入し、培養上清の生物活性を検討した。インタ-ロイキンーの検定をMH60株細胞の増殖促進活性で調べると、添加した血清は用量依存的に細胞増殖を促進した。このことはバイオアッセイ系が正常に作動していることを示している。そこで、この培養上清を初代培養肝細胞系に添加してその機能変化を解析した結果、肝細胞に対する著名な生存促進活性がみられた。また上清の酸性処理でDNA合成の抑制活性が観察された。現在、これらの生理作用を示す遺伝子を探索中である。

Annual は yesterday when the study プ ロ ジ ェ ク ト の basic research と し て ア フ リ カ ツ メ ガ エ ル oocytes の 発 now started の 発 と original culture hepatocytes の new し い 応 answer is の line established を っ た results, not be liver stromal cells が liver cell suppression の raised colonization に important な "を cut fruit た し て い る こ と が.at し た. そ こ で は this year, ヒ ト 単 ball (マ ク ロ フ ァ - ジ) が produce す る kind 々 の factor group の beg を 検 line method of biological engineering で っ た. 1. Activated 単 globulin に specific なcDNAラ ブラリ ブラリ- <e:1>. ヒ ト peripheral blood か ら 単 ball を に separation of refined し, エ ン ド ト キ シ ン で あ る リ ポ ポ リ サ ッ カ ラ イ ド (LPS) で stimulation training し た. LPS no stimulation ヒ ト 単 ball か ら modulation し た poly real ^ + (A) mRNA よ り, LPS (-) cDNA ラ イ ブ ラ リ - を make し, LPS (+) cDNA ラ イ ブ ラ で difference between リ - led き ハ イ ブ リ ダ イ ゼ - シ ョ ン を い, LPS stimulation で 発 now さ れ る specific な cDNA ラ イ ブ ラ リ - を た. 2.In vitroで <s:1> mRNA <s:1> synthesis. Poor written で cropping し た led き cDNA ラ イ ブ ラ リ - か ら T3RNA ポ リ メ ラ - ゼ に よ り in vitro で mRNA を synthetic し た. Synthetic し た mRNA の 検 set は イ ン タ - ロ イ キ ン ー 1 and び ー 6 を プ ロ - ブ と し た ノ ザ ン ブ ロ ッ ト method で い, そ れ ら が 単 ball か ら separation し た mRNA の サ イ ズ と ほ ぼ with じ で あ っ た こ と か ら synthetic さ れ た mRNA が completely lock で あ る こ と が.at し た. 3. Youdaoplaceholder4 による ロ ジェ ジェ ジェ ショ による による biological activity 検 検 Synthesize <s:1> たmRNAをアフリカ メガエ メガエ に oocyte に and inject it into <s:1>, culture supernatant <s:1> biological activity を検 to discuss た た. イ ン タ - ロ イ キ ン ー の 検 set を MH60 plant cells の raised colonization promote activity で adjustment べ る と, add し た は dosage dependent に cells raised serum colonization を promote し た. こ の こ と は バ イ オ ア ッ セ イ department が normal に actuation し て い る こ と を shown し て い る. そ こ で, こ の cultivation in the early qing を generation of liver cell line に add し て そ の function - the を parsing し た results, liver cell に す seaborne る famous な survival to promote active が み ら れ た. Youdaoplaceholder0 supernatant <s:1> acidic treatment でDNA synthesis <s:1> inhibitory activity が観 observe された. Now, the <s:1> physiological function を of である れら shows that す remains in the exploration of 伝 and を である.

项目成果

Chizuko Tsurumi: "cDNA cloning and sequencing for the import precursor of subunit B H^+ーATP synthase from rat mitochondria" Biochem.Biophys.Res.Commun.169. 136-142 (1990)

Chizuko Tsurumi：“来自大鼠线粒体的 B H^+ 亚基输入前体的 cDNA 克隆和测序”Biochem.Biophys.Res.Commun.136-142 (1990)。

Tomihiko HIGUCHI: "cDNA cloning and sequencing for the import precursor of coupling factor 6 in H^+ーATP synthase from rat liver mitochondria" Biochem.Biophys.Res.Commun.171. 1079-1086 (1990)

Tomihiko HIGUCHI：“大鼠肝线粒体 H^+-ATP 合成酶中耦合因子 6 的导入前体的 cDNA 克隆和测序”Biochem.Biophys.Res.Commun.171（1990）。

T.Nakamura,: "Interleukin-1b is a potent growth inhibitor of adult rat hepato cytes in primary culture," Exp. Cell Res.179. 488-497 (1988)

T.Nakamura，：“Interleukin-1b 是原代培养物中成年大鼠肝细胞的有效生长抑制剂，”Exp。

Tsukasa IGAWA: "Hepatocyte growth factor is a potent mitogen for cultured rabbit renal tubular epithelial cells" Biochem.Biophys.Res.Commun.174. 831-838 (1991)

Tsukasa IGAWA：“肝细胞生长因子是培养的兔肾小管上皮细胞的有效有丝分裂原”Biochem.Biophys.Res.Commun.174。

Keiji TANAKA: "Proteasomes(multicatalytic proteinase complex)in eukaryotic cells" Cell Struct.Funct,. 15. 127-132 (1990)

Keiji TANAKA：“真核细胞中的蛋白酶体（多催化蛋白酶复合物）”Cell Struct.Funct，。