先天性アミノ酸尿症の原因としてのヒト塩基性アミノ酸トランスポーターの同定

鉴定人类碱性氨基酸转运蛋白是先天性氨基酸尿症的原因

基本信息

批准号：
05770829
负责人：
善本隆之
金额：
$ 0.58万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1993
资助国家：
日本
起止时间：
1993 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

Ecotropicマウス白血病ウイルスレセプター(ERR)としてクローニングされたタンパク質分子は、細胞内外のアルギニン、リジン等の塩基性アミノ酸の輸送を司るトランスポーターとしても機能する。今回は、まず私達がクローニングしたERRのヒトホモローグ(H13,アミノ酸配列の相同性は87.6%)が、マウス白血病ウイルスのレセプターとしては機能しないことを利用し、ヒトとマウスのキメラ分子、さらにSite-Directed Mutagenesisの手法を用いMutantを作製し、ウイルスレセプターとしての機能及びトランスポーター活性を調べた。その結果、ERR分子中の235番目のTyr残基がウイルス感染に重要なアミノ酸残基であり、またこれらのMutantationはトランスポーター活性にはほとんど影響を与えないことが明らかになった。次に、抗H13モノクローナル抗体を作るため、上述の領域を含む第3番目の細胞外領域とGlutathione S-TransferaseとのFusion Proteinを作製し、アルメニアハムスターに免疫し、その脾臓をAg8.653細胞と細胞融合させ、現在スクリーニング中である。抗体が得られれば、腎臓等の臓器における免疫組織学的検討を行う予定である。一方、二塩基性アミノ酸尿症患者からBiopsyにより採取し樹立した細胞株を東邦大学大森病院より頂き、DNA及びRNAを調製し、現在、Southern及びNorthern Blotを行っている。今後、この細胞のRNAよりこの患者のトランスポーターcDNAをRT-CRによりクローニングし、そのトランスポーター活性を測定する予定である。

蛋白质分子克隆为生态鼠白血病病毒受体（ERR）也是一种转运蛋白，可控制碱性氨基酸在细胞内外的碱性氨基酸的转运。在本文中，我们首先利用了我们克隆的人类的人类同源物（H13，具有87.6％的氨基酸序列同源性）并不能充当鼠白血病病毒的受体，并使用人类和小鼠嵌合分子创建了一种突变体，以及与位置指导的变异作用和迁移的受体和迁移者的功能，并作用于该病毒。结果表明，ERR分子中235的Tyr残基是对病毒感染很重要的氨基酸残基，并且这些突变对转运蛋白活性的影响很小。接下来，为了产生抗H13单克隆抗体，创建了带有谷胱甘肽S-转移酶的融合蛋白，由第三个含有上述区域的细胞外区域，用亚美尼亚仓鼠进行免疫，脾脏与AG8.653细胞融合，并正在筛查。一旦获得抗体，将在肾脏等器官中进行免疫组织学检查。同时，从Toho University Omori医院的Dibasic氨基酸尿症患者的活检收集并建立了细胞系，并准备了DNA和RNA，目前正在南部和北印迹。将来，该患者的转运蛋白cDNA将通过RT-CR从该细胞的RNA克隆，将测量其转运蛋白活性。