チオレドキシン類似インタエレメント酵素群の構造機能相関と分子進化

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1.グルタチオントランスフェラーゼ(GST)の触媒部位のNMRによる解析のための大量発現系の構築大腸菌GSTの触媒機構で最も重要と推定される触媒基は,Cys10の主鎖アミドのNH基である.このNH基がグルタチオンのチオール基のpKaに及ぼす影響をNMRを用いて検討するために,Cys10の主訴アミドのNH基である.このNH基がグルタチオンのチオール基のpKaに及ぼす影響をNMRを用いて検討するために,Cys10のNを^<15>N標識を行う.そのためにCys合成遺伝子が欠損している大腸菌K-12株CBK286(thyA cysE::Tn5)に多コピープラスミドpUC18を用いて大腸菌gst遺伝子を導入し,M9最小培地にアミノ酸を補った合成培地で培養を行い,GSTの発現量を検討した.その結果,大量の発現タンパク質を得た.この発現系についてさらに培養条件や発現タンパク質の精製について検討を行ない,1Lの培養液から最終的に約30mgのGSTを精製することができた.この発現・精製系はCysを^<15>N標識したGST試料を調製する目的に充分適うものである.この発現系を用いてCysを^<15>N標識したGSTを調製し,NMRによるpH滴定などを行う.2.変異原性試験法を利用したGSTの機能解析系の構築GST機能改変による変異原性物質代謝酵素の作製を試みるために,復帰変異を利用した変異原性試験法を応用して大腸菌を用いたアッセイ系を構築することとした.まず,トリプトファン合成能および紫外線による復帰変異能を欠損した大腸菌変異株WP2uvrAのgst遺伝子を破壊したWP2uvrAgst株を作製した.このgst欠損株と,もとのgst発現株を比較することにより大腸菌GSTが処理能力を持つ変異原物質を検索することができ,その作業を進めている.この変異株に新たに別のGST分子,あるいは構造的な改変を施したGST分子をコードする遺伝子を導入して発現させることにより,特定の変異原性物質に対して高い活性を持つ酵素を検索することができる.