哺乳類細胞のDNA複製に関与するDNAヘリカーゼの同定と機能の解析

哺乳动物细胞中参与 DNA 复制的 DNA 解旋酶的鉴定和功能分析

• 批准号: 06780497
• 负责人: 多田 周右
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06780497/
• 关键词: DNA複製; DNAヘリカーゼ; 温度感受性変異株; DNAプライマーゼ

DNAヘリカーゼBが温度感受性になっていると思われるマウスFM3A細胞の変異株、tsFT848株より4種のカラムクロマトグラフィーを用いてDNAヘリカーゼBの部分精製を行った。同様にして精製した野性株由来のDNAヘリカーゼBとの温度感受性を比較したところ、tsFT848細胞由来のDNAヘリカーゼBのDNA依存性ATP分解活性は部分精製された状態であっても非許容温度したでの不安定性が野性株に比べ高まっていた。さらに、部分精製をおこなったことによりヘリカーゼ活性の比較が可能になったが、この結果においてもtsFT848細胞由来のDNAヘリカーゼBの非許容温度下での不安定性が示された。以上の結果より、tsFT848細胞が非許容温度下でDNA合成を停止する原因はDNAヘリカーゼBの温度感受性変異によることが更に強く示唆された。また、tsFT848細胞より部分精製したDNAヘリカーゼBの非許容温度下での失活は一本鎖DNAの共存により防ぐことができるため、細胞内においてもDNAに結合していない状態のDNAヘリカーゼBの失活が温度感受性のDNA合成の低下の原因となっていると考えられる。tsFT848細胞を用いておこなったfiber-autoradiographyにおいても伸長を開始したDNA上での新生DNAの長さには野性株との間に有意な差は見られず、高温による失活の標的はDNAに結合していない状態にあるDNAヘリカーゼBであることを示している。さらにFM3A細胞より精製したDNAヘリカーゼBとDNAプライマーゼの相互作用を調べる目的で、DNAヘリカーゼB共存下でのDNAプライマーゼ活性を測定した。DNAプライマーゼ活性はDNAプライマーゼによって一本鎖M13DNA上に合成されるプライマーRNAを電気泳動により分離する方法を用いて解析した。この結果、DNAプライマーゼによって合成される10ヌクレオチド前後のオリゴリボヌクレオチドがDNAヘリカーゼの共存により著しく増加することが観察された。これはDNAヘリカーゼBがDNA複製に関わっていることをさらに支持する結果である。

DNA ヘ リ カ ー ゼ B が temperature sensitivity に な っ て い る と think わ れ る マ ウ ス の FM3A cells - different strains, tsFT848 よ り four の カ ラ ム ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー を with い て DNA ヘ リ カ ー ゼ の part B line of refined を っ た. With others in に し て refined し た wild plant origin の DNA ヘ リ カ ー ゼ B と の temperature sensitivity を compare し た と こ ろ, tsFT848 cell origin の DNA ヘ リ カ ー ゼ の B DNA dependency ATP decomposition activity は part refined さ れ た state で あ っ て も not allowable temperature し た で の labile が wild strains に higher than べ ま っ て い た. さ ら に, partially refined を お こ な っ た こ と に よ り ヘ リ カ ー の is が ゼ activity may be に な っ た が, こ の results に お い て も tsFT848 cell origin の DNA ヘ リ カ ー ゼ の B not allowable temperature で の labile が shown さ れ た. の above results よ り, が tsFT848 cells of allowable temperature で DNA synthesis を stop す る reason は DNA ヘ リ カ ー ゼ B の temperature sensitivity - different に よ る こ と が more strong に く in stopping さ れ た. ま た, tsFT848 cell よ り part refined し た DNA ヘ リ カ ー ゼ の B not allowable temperature で の deactivation は a lock DNA の coexistence に よ り anti ぐ こ と が で き る た め, intracellular に お い て も DNA に combining し て い な い state の DNA ヘ リ カ ー ゼ B の inactivation が temperature sensitivity の DNA synthesis の と の reasons for low な っ て Youdaoplaceholder0 ると test えられる. TsFT848 cells を using い て お こ な っ た fiber - autoradiography に お い て も elongation を began し た DNA で の newborn DNA の long さ に は wild strains と の に intentionally な difference between は see ら れ ず, high-temperature に よ る inactivation は の target DNA に combining し て い な い state に あ る DNA ヘ リ カ ー ゼ B Youdaoplaceholder0 とを とを shows て る る. さ ら に FM3A cells よ り refined し た DNA ヘ リ カ ー ゼ と B DNA プ ラ イ マ ー ゼ の interaction を adjustable べ る purpose で, DNA ヘ リ カ ー ゼ B under the coexistence で の DNA プ ラ イ マ ー ゼ determination of active を し た. DNA プ ラ イ マ ー ゼ active は DNA プ ラ イ マ ー ゼ に よ っ て a lock M13DNA に synthetic さ れ る プ ラ イ マ ー RNA を electric 気 swimming に よ り separation す を る method with い て parsing し た. こ の results, DNA プ ラ イ マ ー ゼ に よ っ て synthetic さ れ る 10 ヌ ク レ オ チ ド before and after の オ リ ゴ リ ボ ヌ ク レ オ チ ド が DNA ヘ リ カ ー ゼ の coexistence に よ り the し く raised plus す る こ と が 観 examine さ れ た. こ れ は DNA ヘ リ カ ー ゼ が B DNA replication に masato わ っ て い る こ と を さ ら に support す る results で あ る.

项目成果

Masayuki Seki: "Characterization of DNA synthesis and DNA-dependent ATPase activity at a restrictive temperature in temperature-sensitive tsFT848 cells with thermolabile DNA helicase B." Molecular and Cellular Biology. 15. 165-172 (1995)

Masayuki Seki：“在具有不耐热 DNA 解旋酶 B 的温度敏感 tsFT848 细胞中，在限制温度下表征 DNA 合成和 DNA 依赖性 ATP 酶活性。”

Masayuki Seki: "Molecular cloning of cDNA encoding human DNA helicase Q1 which has homology to Escherichia coli Rec Q helicase and localization of the gene at chromosome 12p12" Nucleic Acids Research. 22. 4566-4573 (1994)

Masayuki Seki：“编码与大肠杆菌 Rec Q 解旋酶同源的人类 DNA 解旋酶 Q1 的 cDNA 的分子克隆以及该基因在染色体 12p12 上的定位”《核酸研究》。