動態制御機能を賦与したキメラタンパク質発現ベクターによる新規遺伝子治療戦略

使用具有动态控制功能的嵌合蛋白表达载体的新型基因治疗策略

基本信息

批准号：
15790096
负责人：
西川元也
金额：
$ 2.24万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2004
项目状态：
已结题

项目摘要

In vivo遺伝子導入による治療効果は産生タンパク質によって担われる。従って、導入タンパク質の細胞内・体内動態を制御することでin vivo遺伝子治療の効果増強が期待される。昨年度は、細胞透過ペプチド(CPP)をコードする配列をレポーター遺伝子発現プラスミドDNA (pDNA)に挿入し、タンパク質の遺伝子非導入細胞へのデリバリーを試みた。即ち、CPPとしてHSV VP22を選択し、VP22融合β-ガラクトシダーゼ発現pDNAを構築した。マウスでの検討から、融合タンパク質発現pDNAを用いることで、より広範な細胞でβ-ガラクトシダーゼが検出され、キメラタンパク質発現pDNAの有用性が示された。本年度は、抗原ペプチドをコードするpDNAに対して同様のアプローチを施すことでDNAワクチン効果の増大を試みた。即ち、キメラ抗原発現pDNAを遺伝子導入することで、代表的な抗原提示細胞である樹状細胞(DC)内での抗原の挙動を制御し、これによる抗原提示の増強を試みた。モデル抗原として卵白アルブミンのMHCクラスIエピトープペプチド(Pep ; SIINFEKL)を選択し、これを発現するpDNAを構築した。その際、N末側に小胞体(ER)輸送シグナルを融合することでMHCクラスI分子の存在するERへのデリバリーを試みた(pPep)。また、C末側にER保持シグナル(pPep-ER)をはじめ種々のペプチド、アミノ酸を融合した。マウス樹状細胞株DC2.4細胞に遺伝子導入後の抗原提示活性を評価したところ、pPepでは全く抗原提示が起きなかったのに対し、pPep-ERの場合には、有意に高い抗原提示活性が得られた。pPep-ERは、マウスに皮内投与することで高い細胞傷害性Tリンパ球反応が得られたことから、目的分子の細胞内動態制御による活性増強が実現された。

体内基因转移的治疗作用受到产生的蛋白质的影响。因此，预计通过控制转染蛋白的细胞内和细胞内动力学，体内基因治疗将得到增强。去年，将编码细胞穿透肽（CPP）的序列插入报告基因表达质粒DNA（PDNA），并试图将蛋白质递送到未转染的细胞中。也就是说，选择HSV VP22作为CPP，并构建了表达pDNA的VP22融合β-半乳糖苷酶。从小鼠的研究中，通过使用表达融合蛋白的pDNA在更广泛的细胞中检测到β-半乳糖苷酶，表明表达嵌合蛋白的pDNA的有用性。今年，我们试图通过采用类似的pDNA编码抗原肽来提高DNA疫苗的有效性。也就是说，通过转染嵌合表达抗原的pDNA，控制树突状细胞中抗原的行为（DC），一种典型的抗原呈递细胞，并通过这种方法尝试了抗原表现。选择了卵巢蛋白的MHC I类表位肽（PEP； Siinfekl）作为模型抗原，并构建表达其pDNA。目前，我们试图将MHC I类分子与内质网（ER）转运信号融合在N末端（PPEP）中存在的ER。另外，将各种肽和氨基酸（包括脱离ER的信号（PPEP-ER））融合到C末端。当在小鼠树突状细胞系DC2.4细胞中评估基因转移后的抗原表现活性时，PPEP并未显示出任何抗原表现，而PPEP-ER的抗原表现活性明显更高。对PPEP-ER对小鼠进行施用，以获得高度细胞毒性的T淋巴细胞反应，从而通过控制细胞内动力学来导致靶分子的活性增加。

项目成果

期刊论文数量（12）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

Hydrodynamics-based procedure involves transient hyperpermeability in the hepatic cellular membrane : implication of a nonspecific process in efficient intracellular gene delivery.

基于流体动力学的程序涉及肝细胞膜的瞬时高渗透性：有效细胞内基因传递中非特异性过程的含义。

DOI：
发表时间：
2004
期刊：
J.Gene Med. 6(5)
影响因子：
0
作者：
M.Nishikawa;M.Yamada et al.;M.Maruyama et al.;N.Kobayashi et al.
通讯作者：
N.Kobayashi et al.

K.W.Liang et al.: "Restoration of dystrophin expression in mdx mice by intravenous injection of naked DNA containing full-length dystrophin cDNA"Gene Ther.. (in press).

K.W.Liang 等人：“通过静脉内注射含有全长肌营养不良蛋白 cDNA 的裸 DNA，恢复 mdx 小鼠中肌营养不良蛋白的表达”Gene Ther..（正在出版）。

DOI：
发表时间：
期刊：
影响因子：
0
作者：
通讯作者：

N.Kobayashi et al.: "Hepatic delivery of particulates in the submicron range by a hydrodynamics-based procedure : implications for particulate gene delivery system"J.Gene.Med.. (in press).

N.Kobayashi 等人：“通过基于流体动力学的程序对亚微米范围内的颗粒进行肝脏递送：对颗粒基因递送系统的影响”J.Gene.Med..（出版中）。

DOI：
发表时间：
期刊：
影响因子：
0
作者：
通讯作者：

Tissue and intrahepatic distribution and subcellular localization of a mannosylated lipoplex after intravenous administration in mice.

DOI：
10.1016/j.jconrel.2004.03.021
发表时间：
2004-07
期刊：
Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society
影响因子：
0
作者：
M. Yamada;M. Nishikawa;S. Kawakami;Y. Hattori;T. Nakano;F. Yamashita;M. Hashida
通讯作者：
M. Yamada;M. Nishikawa;S. Kawakami;Y. Hattori;T. Nakano;F. Yamashita;M. Hashida

N.Kobayashi et al.: "Hydrodynamics-based procedure involves transient hyperpermeability in the hepatic cellular membrane : implication of a nonspecific process in efficient intracellular gene delivery"J.Gene Med.. (in press).

N.Kobayashi 等人：“基于流体动力学的程序涉及肝细胞膜的瞬时高渗透性：有效细胞内基因传递中非特异性过程的含义”J.Gene Med..（出版中）。