PCR法及び外来遺伝子発現系による薬物トランスポータ群の構造・機能解析

利用PCR方法和外源基因表达系统分析药物转运蛋白的结构和功能

基本信息

批准号：
07772163
负责人：
齋藤秀之
金额：
$ 0.64万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

薬物の腸管吸収及び腎排泄はベクトル的な経細胞輸送過程であり、上皮細胞膜を構成する刷子縁膜(管腔側)と側底膜(血管側)に局在する輸送系(トランスポータ)の介在によって制御されている。本研究では、PCR法及び外来遺伝子発現系を応用し、薬物トランスポータ群のクローニングとそれに基づく構造・機能解析を目的とした。1)ペプチドトランスポータのcDNAクローニングと構造・機能及び組織分布家兎オリゴペプチドトランスポータPEPT1のアミノ酸配列を参考にPCR法を応用してラットに発現している2種類のペプチドトランスポータのcDNAを単離した。クローン化したラットPEPT1及びPEPT2は、それぞれ710個及び729個のアミノ酸からなる12回膜貫通型タンパク質であった。ノーザンブロット分析並びにPCRによって両トランスポータの臓器分布を調べた結果、PEPT1の発現は小腸に最も多く、腎皮質にも存在すること、一方PEPT2は腎にほぼ特異的に発現していることが示唆された。抗PEPT1抗体を用いてウェスタンブロッティングを行ったところ、PEPT1は十二指腸、空腸及び回腸に強く発現していたが、結腸や直腸では検出されなかった。さらに、免疫染色によってラット小腸並びに近位尿細管刷子縁膜にPEPT1の局在していることが確認された。外来遺伝子発現系を用いた機能解析によって、ラットPEPT1及びPEPT2はβ-ラクタム抗生物質等のペプチド類似薬物を認識し輸送することが明らかとなった。2)腎有機アニオントランスポータのcDNAクローニング及び構造機能解析肝有機アニオントランスポータ(oatp)のアミノ酸配列を基に、腎尿細管特異的に発現している新規有機アニオントランスポータ(OAT-K1)のcDNAをクローニングした。ラットOAT-K1は、一部の腎排泄型アニオン性薬物の尿細管側底膜輸送を媒介していることが示唆された。

药物的肠吸收和肾脏排泄是类似载体的跨细胞运输过程，并且受到构成上皮细胞膜的基底膜（腔侧）和基底外侧膜（管腔侧）和基底外侧膜（血管侧）的干预（转运蛋白）的控制。这项研究应用了PCR方法和外国基因表达系统来克隆药物转运蛋白组，并基于这些方法分析结构和功能。 1）肽转运蛋白的cDNA克隆以及基于兔寡肽转运蛋白pept1的氨基酸序列的结构，功能和组织分布，通过应用PCR方法分离出在大鼠中表达的两种类型的肽转运蛋白的cDNA。克隆的大鼠PEPT1和PEPT2分别为12个跨膜蛋白，分别由710和729个氨基酸组成。通过Northern印迹分析和PCR研究了两个转运蛋白的器官分布，并提出PEPT1表达在小肠中最常见，并且也存在于肾皮质中，而Pept2几乎在肾脏中表达。使用抗pept1抗体进行蛋白质印迹，发现Pept1在十二指肠，空肠和回肠上强烈表达，但在结肠或直肠中未检测到。此外，免疫染色证实，PEPT1位于大鼠的小肠和近端管状刷子边界膜中。使用外国基因表达系统的功能分析表明，大鼠PEPT1和PEPT2识别并转运肽样药物，例如β-内酰胺抗生素。 2）基于肝脏有机阴离子转运蛋白（OATP）的肾脏有机阴离子转运蛋白的克隆和结构功能分析，这是新型有机阴离子转运蛋白转运蛋白（OAT-K1）的cDNA，该cDNA被特异性地表达在肾小管中。有人提出，大鼠燕麦燕麦片介导一些肾脏排泄的阴离子药物的管状基底膜转运。