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多様な生理応答に見られるMAPキナーゼの核移行の生理的意義

MAP 激酶核转位在各种生理反应中的生理意义

基本信息

批准号：
07780606
负责人：
佐藤仁彦
金额：
$ 0.64万
依托单位：
Gifu Pharmaceutical University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07780606/
关键词：
Dominant Negative Mutant MAPキナーゼ MDCK細胞 HGF 核移行クロスリンク

项目摘要

1.MAPキナーゼのDominant Negative Mutant遺伝子を導入・発現させた細胞株の作製MAPキナーゼの変異遺伝子をelongation factor promoterの下流に組み込んだ発現プラスミドを作成し、数種類の細胞に導入した後G418に対する薬剤耐性を指標に細胞を選別した。その結果、分散運動系のモデルであるMDCK細胞で、内在性MAPキナーゼの数倍量変異体が発現している細胞株を幾つか得ることができた。2.H F刺激によるMAPキナーゼの活性と局在性の変化の解析1.で得られたMDCK細胞株及び親細胞においてHGF刺激によるMAPキナーゼの活性化に余り差は認められなかったものの、キナーゼ活性を欠損させた変異体や非リン酸化型変異体を発現している細胞株では、HGF刺激による分散運動がやや遅れる傾向を示した。このことから、これらの変異体がDominant Negative Mutantとして働き得る可能性が示唆された。次に、MAPキナーゼの局在性の変化について蛍光抗体法により解析したところ、(1)MDCK細胞ではHGF刺激によりMAPキナーゼが核移行する、(2)不活性型変異体および非リン酸化型変異体も核移行することからMAPキナーゼの活性及びリン酸化は核移行に関与しない、ことが明らかになった。3.クロスリンク法によるMAPキナーゼ結合蛋白質の解析G0期に同調させたSwiss3T3細胞を血清で刺激し架橋剤で処理した後、ウエスタンブロッティングを行ない抗MAPキナーゼ抗体を用いて解析したところ、刺激前に見られた分子量約160および135kDaのバンドが刺激後5分で消失した。このことから、刺激前にMAPキナーゼに結合していた分子量約120および95kDaの蛋白質が、MAPキナーゼの活性化に伴い外れることが示唆された。

The 1.MAP gene was transferred into the cell line of the existing cell line, the cell line of the cell line was selected as the cell line of the G418 cell, and the cell of the G418 cell was selected after it was introduced into the cell line of the MAP cell. The cell of the elongation factor promoter cell was used to make the cell. The results showed that the MDCK cells of the dispersed animal system were significantly higher than that of the control group, and that of the internal MAP cells was much higher than that of the control group. 2. HF stimulation induced MAP activity analysis 1. The MDCK cell line and the cell line were stimulated by HGF. The activity of the MAP cell line was significantly higher than that of the normal cell line. The activity of the cell line was significantly higher than that of the control group. Please tell me that the possibility of getting a Dominant Negative Mutant is instigated. In the second and third part of the study, MAP antibody method was used to analyze nuclear migration, (1) MDCK, HGF stimulation, MAP, nuclear migration, (2) inactive, non-acidified, inactive, MAP, and acidified nuclei. 3. The G0 phase was analyzed by the method of MAP binding protein. After the serum of the same Swiss3T3 cell stimulated the scaffold, the anti-MAP antibody was used to analyze the antibody, and the molecular weight disappeared in 5 minutes after stimulation. The molecular weight of the antibody disappeared after stimulation. The molecular weight of 95kDa protein was about 120%, and the activation of MAP protein was detected by the combination of the molecular weight of 95kDa protein and the molecular weight of 95kDa protein.