课题基金 / 基金详情

反応中間体の構造解析によるβ-ラクタマーゼの触媒機構の研究

反応中間体の構造解析によるβ-ラクタマーゼの触媒機構の研究
通过反应中间体结构分析研究β-内酰胺酶催化机理
批准号：
07760073
负责人：
足立 博之
金额：
$0.77万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1995
资助国家：
日本
项目状态：
已结题
起止时间：
1995 至 --
来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07760073/
关键词：
β-ラクタマーゼアシル酵素触媒機構蛋白質工学x線結晶機構解析ペニシリンドラッグ・デザイン

项目摘要

项目成果

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中文摘要
翻译
申請者は,RTEM-1β-ラクタマーゼE166N変異体が基質であるペニシリンと安定なアシル中間体を形成することを見いだし、その立体構造をx線結晶構造解析により決定した(Nature 359, 700-705 (1992) )。その構造からSer130側鎖の-OHが前半のアシル化の開環反応で基質のNへのproton donorと考えられ,実際にS130T変異体では、Kmの変化なしにkcatが約1/100に減少した(投稿準備中)。本研究は,このS130T変異体を利用し,低温条件下、^<13>C-NMRにより,蓄積しているはずの正四面体中間体の形成を検出して,予想した反応機構を検証することを目的とする。本年度は,基質のベンジルペニシリンのβ-ラクタム環のカルボニル炭素を^<13>Cで標識した化合物の合成の検討を行った。まず,化学合成によるコールドランを試みたところ,β-ラクタム化合物は非常に不安定で,合成収率が悪いため,原料物質である^<13>C標識化合物の単価を考えると,予算内では十分量合成できないことがわかった。そこで,次に発酵生産を検討した。これは,ペニシリンの生産菌に,安価な^<13>C標識クロレラを食べさせて,その培養から,ペニシリンを精製する方法である。この場合,目的部位以外にも標識が入るが,それらを同定するのは簡単なので,予算を考えてこの方法をとることにした。現在,^<13>CO_2でクロレラを培養して標識クロレラを調整中である。
英文摘要
申請者は,RTEM-1β-ラクタマーゼE166N変異体が基質であるペニシリンと安定なアシル中間体を形成することを見いだし、その立体構造をx線結晶構造解析により決定した(Nature 359, 700-705 (1992) )。その構造からSer130側鎖の-OHが前半のアシル化の開環反応で基質のNへのproton donorと考えられ,実際にS130T変異体では、Kmの変化なしにkcatが約1/100に減少した(投稿準備中)。本研究は,このS130T変異体を利用し,低温条件下、^<13>C-NMRにより,蓄積しているはずの正四面体中間体の形成を検出して,予想した反応機構を検証することを目的とする。本年度は,基質のベンジルペニシリンのβ-ラクタム環のカルボニル炭素を^<13>Cで標識した化合物の合成の検討を行った。まず,化学合成によるコールドランを試みたところ,β-ラクタム化合物は非常に不安定で,合成収率が悪いため,原料物質である^<13>C標識化合物の単価を考えると,予算内では十分量合成できないことがわかった。そこで,次に発酵生産を検討した。これは,ペニシリンの生産菌に,安価な^<13>C標識クロレラを食べさせて,その培養から,ペニシリンを精製する方法である。この場合,目的部位以外にも標識が入るが,それらを同定するのは簡単なので,予算を考えてこの方法をとることにした。現在,^<13>CO_2でクロレラを培養して標識クロレラを調整中である。
期刊论文(1)
专著(0)
科研奖励(0)
会议论文
T. Morio: "Bsr-REMI : An Improved Method for Gene Tagging Using a New Vector in Dictyostelium." J. Plant Res.108. 111-114 (1995)
T. Morio：“Bsr-REMI：一种使用盘基网柄菌新载体进行基因标记的改进方法。”
DOI： --
发表时间：
期刊：
影响因子： --
作者： []
通讯作者：
細胞性粘菌における細胞骨格制御のポストゲノム解析
  • 批准号：
    16013209
  • 项目类别：
    Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
  • 资助金额：
    $4.48万
  • 财政年份：
    2004
  • 负责人：
    足立 博之
  • 依托单位：
    The University of Tokyo
細胞性粘菌における細胞骨格制御のポストゲノム解析
  • 批准号：
    15013211
  • 项目类别：
    Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
  • 资助金额：
    $4.48万
  • 财政年份：
    2003
  • 负责人：
    足立 博之
  • 依托单位：
    The University of Tokyo
細胞性粘菌における細胞骨格制御のポストゲノム解析
  • 批准号：
    14014207
  • 项目类别：
    Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
  • 资助金额：
    $3.71万
  • 财政年份：
    2002
  • 负责人：
    足立 博之
  • 依托单位：
    The University of Tokyo
細胞性粘菌における細胞骨格制御のポストゲノム解析
  • 批准号：
    13206023
  • 项目类别：
    Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
  • 资助金额：
    $5.06万
  • 财政年份：
    2001
  • 负责人：
    足立 博之
  • 依托单位：
    The University of Tokyo
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