分子進化実験によるペニシリンの標的と分解を分ける酵素構造の解析

本研究は、ペニシリンの標的であるペニシリン結合タンパク質(PBP2)とペニシリン分解酵素のβ-ラクタマーゼの構造の類似性に着目して、PBP2にin vivoまたはin vitroで変異を導入して発現させ、ペニシリン耐性で選択してPBP2からβ-ラクタマーゼを進化させることを目的とした。変異位置を同定し、タンパク質の三次構造と対応させることで、標的と分解をわける機構の解明ができるはずである。in vivoでは、強烈なmutator大腸菌中、プラスミド上のPBP2に変異を導入し、世代時間ごとに、細胞より分離した変異PBP2ライブラリを野生型の大腸菌に導入したが、この方法では耐性株は得られなかった。一方、プラスミドを持つmutatorを世代時間ごとにそのままペニシリンで選択すると、プラスミドを導入してから3日目以降の細胞からは最大50μg/mlという高いペニシリンに対して耐性を示すものが得られた。しかし、その株からプラスミドを分離して、野生株に再導入しても耐性を示すものは得られなかった。細胞の中でプラスミドがヘテロになっている可能性が考えられ、さらに高い頻度の形質転換法を検討する必要がある。一方、in vitroでは、Taq polymeraseのerrorを用いる方法を検討したところ、宝社のExTaqでPCRを行うと約400塩基に一回の変異がランダムに導入されることがわかった。この変異遺伝子断片ライブラリをプラスミドにクローニングしてペニシリンで選択中であるが、現在のところクローンは得られていない。1アミノ酸置換のみでは目的のクローンが得られない可能性があり、現在error率を強制的にあげてクローンを選択中である。おそらく、数アミノ酸の置換でクローンが得られると考えており、PCR法を中心にさらにスクリーニングを続けることで目的のクローンが得られるものと考えている。

本研究は、ペニシリンの標的であるペニシリン結合タンパク質(PBP2)とペニシリン分解酵素のβ-ラクタマーゼの構造の類似性に着目して、PBP2にin vivoまたはin vitroで変異を導入して発現させ、ペニシリン耐性で選択してPBP2からβ-ラクタマーゼを進化させることを目的とした。変異位置を同定し、タンパク質の三次構造と対応させることで、標的と分解をわける機構の解明ができるはずである。in vivoでは、強烈なmutator大腸菌中、プラスミド上のPBP2に変異を導入し、世代時間ごとに、細胞より分離した変異PBP2ライブラリを野生型の大腸菌に導入したが、この方法では耐性株は得られなかった。一方、プラスミドを持つmutatorを世代時間ごとにそのままペニシリンで選択すると、プラスミドを導入してから3日目以降の細胞からは最大50μg/mlという高いペニシリンに対して耐性を示すものが得られた。しかし、その株からプラスミドを分離して、野生株に再導入しても耐性を示すものは得られなかった。細胞の中でプラスミドがヘテロになっている可能性が考えられ、さらに高い頻度の形質転換法を検討する必要がある。一方、in vitroでは、Taq polymeraseのerrorを用いる方法を検討したところ、宝社のExTaqでPCRを行うと約400塩基に一回の変異がランダムに導入されることがわかった。この変異遺伝子断片ライブラリをプラスミドにクローニングしてペニシリンで選択中であるが、現在のところクローンは得られていない。1アミノ酸置換のみでは目的のクローンが得られない可能性があり、現在error率を強制的にあげてクローンを選択中である。おそらく、数アミノ酸の置換でクローンが得られると考えており、PCR法を中心にさらにスクリーニングを続けることで目的のクローンが得られるものと考えている。