PHドメインを含むGタンパク質共役型受容体キナーゼの機能解析

含PH结构域的G蛋白偶联受体激酶的功能分析

基本信息

批准号：
08670140
负责人：
東原和成
金额：
$ 1.34万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08670140/
关键词：
受容体キナーゼ PHドメインリン脂質 Gタンパク質

项目摘要

本研究では、Gタンパク質共役型受容体キナーゼ(βARK)のPHドメインを介した膜移行の生理的意義を分子レベルで解析するため、PHドメイン内の部位特異的変異株を作り、PHドメインリガンドであるGBγとPIP2のβARK活性に対するin vivoでの必要性を調べた。すなわち、βARKはPHドメインを介してPIP2とGβγに結合することがin vitroの系では示されているが、これらの相互作用が生理的に意味があるかは不明である。そこで、上記のin vitroでのPHドメインの機能を失ったβARK変異体が、培養細胞内in vivoでも機能を失うかを検索した。すでに報告ずみのPHドメインのfusion蛋白質での解析結果をもとに、PHドメイン内のアミノ酸を部位特異的に変異させたβARKの発現ベクターを作製した。エピトープタグをつけたムスカリン受容体とアドレナリン受容体を用い、細胞を[^<32>P]リン酸とアゴニストの有無で保温し、受容体を可溶化後エピトープに対する抗体を用いて沈降させ受容体のリン酸化を調べた。Gβγへの結合に重要な部位を変異させたβARKは、アゴニスト依存性のレセプターのリン酸化能力を失ったが、PIP2の結合部位の変異はなんらin vivoでの影響を認められなかった。そこで、私は、PIP2以外のリン脂質の関わりを推定し、PS(phosphatidylserine)の効果をin vitroで調べたところ、Gβγの存在下でPSはβARKの膜移行を促進した。このことは、PIP2のPHドメインへの結合による膜移行は唯一の機構ではないことを示している。以上の結果より、PHドメインにGβγが結合することはβARKの活性化に不可欠で、PIP2やPSといったリン脂質が関わっていることが示唆された。

在这项研究中，我们分析了G蛋白偶联受体激酶（βARK）在分子水平上的膜介导的膜转移的生理意义，并在pH结构域内创建了定位的突变体，并检查了pH域GBγ和PIP2和PIP2的βARK活性的体内必需性。也就是说，尽管在体外系统中已经表明βARK通过pH结构域与PIP2和Gβγ结合，但尚不清楚这些相互作用是否具有生理意义。因此，我们搜索了在体外失去pH结构域功能的βARK突变体是否也失去了其在培养细胞中的体内功能。基于对pH结构域融合蛋白的分析结果，βARK的表达载体在其中制备了位点特异性突变的pH结构域内的氨基酸。使用表位标记的毒蕈碱受体和肾上腺素能受体，在存在或不存在[^<32> p]磷酸盐和激动剂的情况下保持温暖，并在溶解后，使用对表育体的抗体沉淀该受体以检查受体的磷酸化。 βARK突变的位点对于与Gβγ结合很重要，失去了其激动剂依赖性受体磷酸化能力，但在PIP2结合位点中的突变在体内不受影响。因此，我估计了除PIP2以外的磷脂的参与，并研究了PS（磷脂酰丝氨酸）在体外的作用，并发现PS在Gβγ存在下促进了βARK的膜转移。这表明膜通过PIP2与pH结构域的结合迁移并不是唯一的机制。以上结果表明，Gβγ与pH结构域的结合对于βARK的激活至关重要，并且涉及PIP2和PS等磷脂。