中枢カテコールアミンニューロンをモデルにした神経回路形成のマウス遺伝学的解析

以中枢儿茶酚胺神经元为模型进行小鼠神经回路形成的遗传分析

• 批准号: 10156226
• 负责人: 小林 和人
• 金额: $ 0.96万
• 依托单位: Nara Institute of Science and Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 1998
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1998 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10156226/
• 关键词: ドーパミンニューロン; 緑色蛍光タンパク質; チロシン水酸化酵素; 軸索ガイダンス; トランスジェニックマウス

中脳ドーパミンニューロンの軸索ガイダンスをリアルタイムでモニターするため、このニューロン特異的にgreen fluorescence protein(GFP)を発現するトランスジェニックマウスの作製を行った。カテコールアミンニューロンのマーカー酵素であるチロシン水酸化酵素(TH)の遺伝子プロモーターにGFP遺伝子を接続した導入遺伝子を持つトランスジェニックマウス系統において、カテコールアミンニューロン特異的にGFPの発現が認められた。トランスジェニックの中脳組織片(E11.5)をコラーゲンゲル中で培養することによって、ドーパミンニューロン軸索の伸長をGFPによってリアルタイムで検出することが可能であった。この軸索の伸長は、底板により反発性に制御され、また、whole mountでの脳の展開培養下で、吻側方向への特徴的なパターンを示した。培養下での軸索の応答は、本来のドーパミンニューロンの性質を反映しており、GFPの蛍光を利用してドーパミン性軸索の挙動をモニターできることが示された。TH-GFPマウスを利用すれば、セルソーターによってドーパミンニューロンを濃縮することも可能であり、この細胞集団に特異的なモノクローナル抗体の作製や特異的な遺伝子を探索するアプローチを提供する。今後、中脳ドーパミンニューロンの神経回路形成を制御する分子の探索およびその機構の解明を進める計画である。また、組織特異的な遺伝子ターゲティング法(Cre-loxPシステム)を用いて、中枢神経回路形成におけるグリコシルフォスファチジルイノシトール(GPI)アンカー蛋白質および低分子量GTP結合蛋白質Rhoの機能解析を行った。組織特異的プロモーターとして、ノルアドレナリン合成を触媒するドーパミンβ-水酸化酵素(DBH)遺伝子を利用した。本プロモーターは、中枢ノルアドレナリンニューロン、交感神経、運動神経などで組織特異的に発現する。GPIアンカー蛋白質の組織特異的な欠損により、神経細胞の生存や軸索伸長には異常がないものの、自律神経および運動神経の失調が認められ、両者の神経伝達に機能的に関与するGPIアンカー蛋白質の存在が示唆された。また、Rho機能の組織特異的な抑制によって、このGTPaseが少なくとも運動神経の軸索走行に重要な役割を持つことを見い出した。

为了实时监测中脑多巴胺神经元的轴突引导，产生了表达这种神经元特异性绿色荧光蛋白（GFP）的转基因小鼠。在转基因小鼠菌株中，具有转基因的转基因小鼠菌株中特异性观察到GFP表达，该转基因将GFP基因与儿茶酚胺神经元的标记酶（TH）连接到酪氨酸羟化酶基因启动子（TH）。通过在胶原蛋白凝胶中培养转基因中脑组织片段（E11.5），可以通过GFP实时检测多巴胺神经元轴突的延伸。该轴突延伸由基板排斥控制，并在整个安装座上发达的脑文化下显示出独特的和其图案。培养中的轴突反应反映了天然多巴胺神经元的性质，表明GFP荧光可用于监测多巴胺轴突的行为。使用TH-GFP小鼠，多巴胺神经元也可以通过细胞分散剂富集，从而提供了一种产生特定于该细胞群体并探索特定基因的单克隆抗体的方法。将来，我们计划寻找控制中脑多巴胺神经元中神经回路形成的分子，并阐明这些神经回路的机制。此外，使用组织特异性基因靶标（CRE-LOLOXP系统）进行了中枢神经系统回路中糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚固蛋白和低分子量GTP结合蛋白RHO的功能分析。催化去甲肾上腺素能合成的多巴胺β-羟化酶（DBH）基因被用作组织特异性启动子。该启动子在中央甲肾上腺能神经元，交感神经，运动神经等中特异性表达。尽管GPI锚固蛋白的组织特异性缺乏并不引起神经元生存或轴突延伸的神经元延伸，自主性和运动神经的异常，这意味着GPI的存在与GPI蛋白质相关的protot在neUROT中的存在。此外，我们发现该GTPase通过组织特异性抑制RHO功能在运动神经的轴突运行中起着重要作用。

项目成果

Sawada et al.: "Autonomic neuropathy in transgenic mice caused by immunotoxin targeting of the peripheral nervous system" J.Neurosci.Res.51,2. 162-173 (1998)

Sawada 等人：“免疫毒素靶向周围神经系统引起的转基因小鼠自主神经病变”J.Neurosci.Res.51,2。

Nishii et al.: "Motor and learming dysfunction during postnatal development in mice defective in dopamine neuronal transmission" J.Neurosci.Res.54,4. 450-464 (1998)

Nishii 等人：“多巴胺神经元传递缺陷小鼠产后发育过程中的运动和学习功能障碍”J.Neurosci.Res.54,4。