分子シャペロンによるG1サイクリン依存キナーゼ(cdk4)の機能制御

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前年度に単離したK4-1(新規DnaJ様蛋白質)とCDC37の両分子シャペロンについて細胞内における挙動、機能についてより詳細に検討を行った。まず、それぞれに対する特異的抗体をウサギを用いて作製した。アフィニティー精製によりさらに特異性を高め、これを用いて内在性のK4-1とCDC37の細胞内局在とその変動を調べた結果、前年度までに得られた結果と同じ結論を得、強制発現やタグの付加がこれらのタンパクの挙動に影響を与えていないことを立証した。次に、GFP-CDK4を作製しK4-1やCDC37がCDK4の細胞内局在に与える影響を調べた。その結果、K4-1とCDC37はともにCDK4単量体を細胞質に留め置き、制御サブユニットであるサイクリンDの存在下で複合体を形成させ核内へと移行させることを明らかにした。次に、K4-1とCDC37が細胞周期(特にGl期)の進行における役割を検証するために、それぞれに対する特異的な精製抗体を培養細胞内にマイクロインジェクションしGl期進行に対する影響を解析した。その結果、K4-1に対する抗体はほとんど効果を示さなかったが、CDC37の機能を抗体で中和するとGl初期から後期への進行が阻害される結果を得た。CDC37はCDK4単量体と結合するがサイクリンDとは相互作用しないにもかかわらず、CDC37の機能を中和した細胞ではCDK4のみならずサイクリンDもその発現が抑制されていた。サイクリンDとCDK4を強制発現すると部分的にではあるがGl期進行を回復したことから、CDC37の下流にサイクリンDとCDK4の両者を位置ずけることができる。現在、サイクリンDの発現制御に関与するCDC37の標的を探索中である。