転写因子E2F-1が染色体DNA複製開始を誘導する機構の分子解析

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転写因子E2Fが染色体DNA複製開始を誘導する機構を二つの系を用いて解析した。(1)哺乳類培養細胞系を用いた解析 マウス線維芽細胞株NIH3T3にメタロチオネインプロモーターと連結したヒトE2F-1cDNAを導入し、亜鉛を培地に添加することによりE2F-1の発現を誘導できる細胞株を樹立した。この細胞を低血清培地にて休止期に同調させ、E2F-1の発現誘導により細胞がS期へと進行する過程を詳細に検討した結果、E2F-1の下流には、サイクリンEの発現によるCdk2の活性化とDNA複製開始装置の構成因子であるMCMの染色体への結合を促進する過程の、少なくとも、二つの経路が律速段階として存在することを明らかにした。(2)アフリカツメガエル卵を用いた解析 われわれは昨年度までに、アフリカツメガエルの未成熟卵を用いてDNA複製開始を検定できる系を構築していたので、これを用いてE2FとCdk2活性の関与を解析した。その結果、カエル卵においては、E2F活性のみでは不十分であるが、サイクリンE/Cdk2複合体と協調するとDNA複製開始が誘導できること、この系においてはサイクリンEの発現はE2Fに依存しないこと、さらにはE2Fの標的遺伝子にサイクリンE以外のものが存在することを明らかにした。カエル卵においては、ほとんどの蛋白質の発現はすでに存在しているmRNAのpolyA付加により制御されることが知られているので、外部から導入した転写因子により活性化された遺伝子を同定するには理想的な系である。この利点を生かし、ディファレンシャルディスプレイ法を用いてE2Fにより発現が特異的に上昇する遺伝子の断片を4種類同定した(仮称 CET-1、-2、-3、-4)。このうち比較的強く誘導された遺伝子断片(CET-1と2)をクローニングし、現在、完全長のcDNAを単離し、解析中である。