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小型ツメガエルを用いた、MBT特異的発現遺伝子の網羅的解析

小非洲爪蟾 MBT 特异性表达基因的综合分析

基本信息

批准号：
13202042
负责人：
加藤順也
金额：
$ 3.84万
依托单位：
Nara Institute of Science and Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

両生類の初期発生過程におけるMid Blastula移行(MBT)では、Zygoticな転写と細胞分化の開始、間期の出現と体細胞型への細胞周期の変換が起こるが、その分子機構の解明は大きな命題の一つである。本研究では小型ツメガエル(X.tropicalis)を用いてMBTの分子機構を解析し、以下の結果を得た。(1)細胞周期や初期発生に関与することが予測される遺伝子のうちMBT後に転写誘導されるものについて、優性不能型E2Fタンパク質の導入による影響を調べたところ、サイクリンD1とTbx2の発現量が減少することを見いだした。(2)前年度に得られた、MBT後に発現量が増加する遺伝子断片150クローンにつきRT-PCRとノーザン法により発現誘導を検定し、MBT後に著明に発現量が増加する遺伝子を1クローン同定した。そのcDNAを単離し塩基配列を決定してコードされるタンパク質を予想した。(3)MBT後に発現量が増加する候補クローンをさらに多く得るために、ディファレンシャルディスプレイ法を併用した。予備実験の結果、MBT後に転写量が増加する遺伝子断片の候補を100クローン同定した。このうち20個をランダムに選びノーザン法により検定したところ、1クローンの転写量がMBT後に著明に増加することがわかった。(4)MBT後に発現が誘導される遺伝子(サイクリンD1、Pax2、Xic1など)のうち、Xic1の5'上流領域を含むゲノムDNAを単離し、5'RACE法によりXic1の転写開始点を決定し、プロモーター領域を単離した。このゲノム断片にレポーターとしてGFPを連結しカエルに導入した。(5)サイクリンD1プロモーターの段階的欠失変異体をトランスジェニック個体にて解析し、特異的発現誘導に必要な領域を定め、その必要十分性について検討した。また、この領域に存在する既知の転写因子の結合部位を検索し、点突然変異を導入することにより、この部位の必要性を証明した。また、この部位に特異的に結合する細胞性因子をカエル初期胚の細胞抽出液内に見いだした。

During the early development of the species, the Mid Blastula Transition (MBT) is the beginning of cell differentiation, the appearance of interphase, the initiation of somatic cell cycle transition, and the elucidation of molecular mechanisms. In this study, the molecular structure of MBT was analyzed by using X.tropicalis, and the following results were obtained. (1)The effects of cell cycle initiation on cell cycle prediction, cell cycle induction, and cell cycle differentiation on cell cycle initiation, cell cycle induction, and cell cycle differentiation, as well as on cell cycle differentiation, cell cycle initiation, and cell cycle differentiation, as well as on cell cycle differentiation, and cell cycle differentiation, as well as on cell cycle differentiation, and on cell cycle differentiation, as well as on cell cycle differentiation, and on cell cycle differentiation, were investigated. (2)In the previous year, the detection amount of MBT increased, and the detection amount of MBT increased. The sequence of cDNA fragments is determined by the sequence of cDNA fragments. (3) Increase in the amount of MBT post-discovery, and use of the candidate method The results of the preparation, the number of MBT post-write increases, and the number of candidate fragments increases to 100. This is due to the fact that the selection of 20 weblogs and the use of the online method have been determined, and the number of pages written on one page has increased significantly since MBT. (4)MBT post-discovery induction genes (XicD1, Pax2, Xic1) and 5'upstream region of Xic1 contain DNA, 5' RACE method determines Xic1 writing start point, and 5'RACE method determines Xic1 writing start point and 5' upstream region. This is the first time I've ever seen one. (5)The analysis of individual, specific occurrence induction, necessary field determination, and necessary degree of abnormality of the level of the class are discussed. To prove the necessity of the existence of the known binding sites of the writing factors and the introduction of the sudden differences of the points. This site-specific combination of cellular factors is found in the extract of embryonic cells.