転写因子TFIIFの伸長因子としての機能解析

转录因子TFIIF作为延伸因子的功能分析

基本信息

批准号：
10173210
负责人：
北嶋繁孝
金额：
$ 1.6万
依托单位：
Tokyo Medical and Dental University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10173210/
关键词：
転写伸長因子 TFIIF トリプシン分解 3極構造開始型伸長型

项目摘要

1。 TFIIF機能の解析(1)TFIIFサブユニットRAP30.74のバキュロウイルス発現系を用いて、昆虫細胞で同時に感染させることにより両サブユニットが等モル比で会合したIIFを作製した。一方、他の基本因子(ヒトTBP,IIB,IIE)のリコンビナント型、ラットIIH.ヒトRNAポリメラーゼIIを精製し、これらによるin vitro転写活性を再構成した。次に、アデノウイルス主要後期遺伝子の最小プロモーターDNAを用いて、"開始型"IIFモデルを作製した。同時にIIF単独"遊離型IIF"、IIF/PolII/DNA複合体"伸長型IIF"を含めてトリプシン消化によるIIF構造の解析を行った。RAP74は、N-末約20K,C-末15Kほどの球状ドメイン、その間のチャージに富む中央ドメインは高いトリプシン感受性を持つランダム構造をとり、3極(Tripartite)構造をもつことがわかった。RAP30は、74分解後に約14Kの断片に切断されIIF分子内に74に覆われた格好で配位することがわかった。開始型、伸長型RAP74の分解パターンは遊離型のものと大きな変化を認めず、特異的分解産物の出現も認めなかった。しかしながら、RAP30の分解は著明に阻害され、開始/伸長複合体ではRAP30はDNAと結合しトリプシンがさらに作用しにくい状態へ変化するものと考えられた。以上、RAP74の中央ランダム構造はIIF分子の外側に配位しているがこの領域の活性は不明である。ただ、ヒト、ハエ、Xenopus RAP74の間で保存されており何らかの機能を持つことが示唆される。また、今回同定できたC-末の球状構造ドメインの機能も不明なままである。(2) 核抽出蛋白から、伸長型PolIIの単離を試みた。結果はまだ不十分であるが継続する。

1。使用baculovirus表达系统的TFIIF亚基RAP30.74分析TFIIF函数（1），生产了IIF，其中两个亚基通过同时感染昆虫细胞以等效比率相关。另一方面，其他基本因素的重组形式（人类TBP，IIB，IIE），大鼠IIH。纯化了人RNA聚合酶II，并重新组建了体外转录活性。接下来，使用主要晚期腺病毒基因的最小启动子DNA生成了“启动” IIF模型。同时，通过胰蛋白酶消化分析了IIF结构，包括单独的IIF“免费IIF”和IIF/Polii/DNA复合物“扩展类型IIF”。发现RAP74的球形结构域约为20K N末端和15K C端，并且它们之间的富电荷中心结构域具有具有较高胰蛋白酶灵敏度的随机结构，并且具有三方结构。发现Rap30分解74后被裂解成约14K的片段，并与IIF分子中的74覆盖。启动和扩展Rap74的降解模式与自由类型没有显着改变，也没有观察到特定的降解产物。但是，Rap30的降解受到明显抑制，人们认为在启动/扩展复合物中，Rap30与DNA结合，导致胰蛋白酶变得更加难以作用。 Rap74的中央随机结构在IIF分子之外坐标，但该区域的活性尚不清楚。但是，它在人类，苍蝇和爪蟾Rap74之间是保守的，并表明它具有一定的功能。此外，鉴定出的C末端的球形结构结构域的功能仍然未知。（2）试图将扩展的polii与核提取蛋白分离。结果仍然不足，但仍在继续。