転写因子TFIIFの伸長因子としての機能解析

1。 TFIIF機能の解析(1)TFIIFサブユニットRAP30.74のバキュロウイルス発現系を用いて、昆虫細胞で同時に感染させることにより両サブユニットが等モル比で会合したIIFを作製した。一方、他の基本因子(ヒトTBP,IIB,IIE)のリコンビナント型、ラットIIH.ヒトRNAポリメラーゼIIを精製し、これらによるin vitro転写活性を再構成した。次に、アデノウイルス主要後期遺伝子の最小プロモーターDNAを用いて、"開始型"IIFモデルを作製した。同時にIIF単独"遊離型IIF"、IIF/PolII/DNA複合体"伸長型IIF"を含めてトリプシン消化によるIIF構造の解析を行った。RAP74は、N-末約20K,C-末15Kほどの球状ドメイン、その間のチャージに富む中央ドメインは高いトリプシン感受性を持つランダム構造をとり、3極(Tripartite)構造をもつことがわかった。RAP30は、74分解後に約14Kの断片に切断されIIF分子内に74に覆われた格好で配位することがわかった。開始型、伸長型RAP74の分解パターンは遊離型のものと大きな変化を認めず、特異的分解産物の出現も認めなかった。しかしながら、RAP30の分解は著明に阻害され、開始/伸長複合体ではRAP30はDNAと結合しトリプシンがさらに作用しにくい状態へ変化するものと考えられた。以上、RAP74の中央ランダム構造はIIF分子の外側に配位しているがこの領域の活性は不明である。ただ、ヒト、ハエ、Xenopus RAP74の間で保存されており何らかの機能を持つことが示唆される。また、今回同定できたC-末の球状構造ドメインの機能も不明なままである。(2) 核抽出蛋白から、伸長型PolIIの単離を試みた。結果はまだ不十分であるが継続する。

1。 TFIIF機能の解析(1)TFIIFサブユニットRAP30.74のバキュロウイルス発現系を用いて、昆虫細胞で同時に感染させることにより両サブユニットが等モル比で会合したIIFを作製した。一方、他の基本因子(ヒトTBP,IIB,IIE)のリコンビナント型、ラットIIH.ヒトRNAポリメラーゼIIを精製し、これらによるin vitro転写活性を再構成した。次に、アデノウイルス主要後期遺伝子の最小プロモーターDNAを用いて、"開始型"IIFモデルを作製した。同時にIIF単独"遊離型IIF"、IIF/PolII/DNA複合体"伸長型IIF"を含めてトリプシン消化によるIIF構造の解析を行った。RAP74は、N-末約20K,C-末15Kほどの球状ドメイン、その間のチャージに富む中央ドメインは高いトリプシン感受性を持つランダム構造をとり、3極(Tripartite)構造をもつことがわかった。RAP30は、74分解後に約14Kの断片に切断されIIF分子内に74に覆われた格好で配位することがわかった。開始型、伸長型RAP74の分解パターンは遊離型のものと大きな変化を認めず、特異的分解産物の出現も認めなかった。しかしながら、RAP30の分解は著明に阻害され、開始/伸長複合体ではRAP30はDNAと結合しトリプシンがさらに作用しにくい状態へ変化するものと考えられた。以上、RAP74の中央ランダム構造はIIF分子の外側に配位しているがこの領域の活性は不明である。ただ、ヒト、ハエ、Xenopus RAP74の間で保存されており何らかの機能を持つことが示唆される。また、今回同定できたC-末の球状構造ドメインの機能も不明なままである。(2) 核抽出蛋白から、伸長型PolIIの単離を試みた。結果はまだ不十分であるが継続する。