HDLによる細胞コレステロール搬出系におけるカベオリンの意義

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カベオリン-1はアミノ酸178個からなり、中央部の細胞膜結合ドメイン(アミノ酸102-134)を介して細胞膜に結合し、N末端及びC末端を細胞質側に向けたヘアピン状の構造をとると考えられている。機能ドメインとして、2つのへリックスドメイン(アミノ酸28-56、並びに57-75)、Ras蛋白結合ドメイン(アミノ酸82-101)、上述の細胞膜結合ドメイン、及びコレステロールセンシングドメイン(アミノ酸119-122)が言われているが、これら各ドメインの生細胞内での役割、特にコレステロール代謝平衡に関わる機能については、直接的な生化学的証明がない。本研究では、1. イヌカベオリン-1cDNAをクローニングし、c-Myc及び7つのヒスチジンかなるtagを付加した後、動物細胞系の発現ベクターpcDNA3に組み込み、カベオリン-1発現プラスミドを構築した。2. PfuDNAポリメラーゼによるPCRと、鋳型のメチル化DNAを特異的に断するDpnIを用いた部位特異的変異導入法によって、上記のヘワックスドメイン、Ras蛋白結合ドメイン、細胞膜結合ドメイン、及びコレステロールセンシングドメインを選択的に欠失さたカベオリン-1欠失変異体を作製した。3. これらの欠失変異体、並びにカベオリン-1全長をCOS-7細胞に一過性に過剰発現させる実験系を確立した。現在、アビジンによって細胞膜蛋白を標識した後、遠心法による細胞分画を行い、リコンビナントカベオリン-1の細胞内分布、並びに細胞膜遊離コレステロールの増減を検討中である。予備的検討の結果では、カベオリン-1の過剰発現は、細胞遊離コレステロールのefflux更にはinfluxに著明に影響し、特に一番目のへワックスドメインの欠失変異体は、ドミナントアクティブに機能することが示唆されている。