エナージトランスファーを利用した生細胞内繊維化アクチンの選択的可視化の試み

尝试利用能量转移选择性地观察活细胞中的原纤维化肌动蛋白

基本信息

批准号：
10878129
负责人：
祐村恵彦
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Yamaguchi University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10878129/
关键词：
エナージトランスファー

项目摘要

エナージトランスファーの効率がよい2種の色素で精製したアクチンに標識した。標識アクチンの混合比を最大のエナージトランスファー効率になるように、試験管内で決定した。試験管内で標識アクチンを繊維化させ、繊維化したアクチンのみが観察できる条件を設定した。in vitroの状態では、アクチン繊維一本一本を見ることが予想されたが、トランスファー効率が低いため、束になったもので確認できるレベルであった。次に、上での予備実験をもとに、2種の標識アクチンを細胞内に導入した。導入は、エレクトロポレーション法を用いた。エナージトランスファーによって繊維化アクチンのみが観察できた。ただやはりトランスファー効率が低いため、画像としては弱く、さらに超高感度のカメラが必要であろう。精製蛋白を化学的に蛍光標識する代わりに、green fluorescence proteinとbluefluorescence protein(GFP.BFP;ともに、クラゲ蛍光蛋白質)とそれぞれ融合させたアクチンを細胞内で発現させることを試みている。現在GFP-アクチン遺伝子の発現に問題があり、検討中である。この両蛍光蛋白質間でもエナージトランスファーが起こることが報告されているので、細胞内の繊維化アクチンを可視化できると考えられる。

肌动蛋白用两种染料标记为纯化，这些染料高效地具有enage转移的效率。在体外确定标记肌动蛋白的混合比，以提供最大的enage转移效率。将标记的肌动蛋白纤维纤维形成在试管中，并设置了只能观察到纤维肌动蛋白。在体外状态下，预计每种肌动蛋白纤维将被看到，但是由于转移效率低，它的水平可以在捆绑中看到。接下来，基于上述初步实验，将两种标记的肌动蛋白类型引入了细胞中。引入是使用电穿孔方法进行的。只能通过enage转移观察到纤维肌动蛋白。但是，由于传输效率仍然很低，因此图像很弱，可能需要超高的灵敏度摄像头。我们试图在化学上标记纯化的蛋白质，而是试图表达肌动蛋白在细胞内与绿色荧光蛋白和蓝荧光蛋白（GFP.BFP；两种水母荧光蛋白）融合。当前，GFP-肌动蛋白基因的表达存在问题，目前正在研究中。据报道，enage转移发生在这两种荧光蛋白之间，并且人们认为可以可视化细胞中的纤维肌动蛋白。