遺伝子改変による非筋細胞ミオシンの機能解析

通过基因修饰对非肌肉细胞肌球蛋白进行功能分析

• 批准号: 08680768
• 负责人: 祐村 恵彦
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Yamaguchi University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08680768/
• 关键词: エレクトロポレーション; ミオシン; 細胞性粘菌; リン酸化

1)細胞性粘菌のミオシンは他の多くの非筋細胞と同様、重鎖および調節軽鎖がリン酸化を受ける。ミオシン重鎖のリン酸化はC末に近い3つのスレオニン残基で起こる。また、軽鎖のリン酸化は1つのセリン残基で起こる。これらのリン酸化が起こらない次の3種の変異体を用いた。(1)重鎖のリン酸化されるスレオニン残基をすべてセリン残基に置換した遺伝子をミオシン重鎖欠損変異体に導入したもの。この改変ミオシンでは重鎖のリン酸化は起こらない。(2)重鎖の調節軽鎖結合ドメインを欠いた遺伝子を導入したもの。この改変ミオシンでは、調節軽鎖を持たず軽鎖リン酸化による調節を受けない。(3)さらに、両者を欠損させた重鎖、軽鎖ともリン酸化がまったく起こらない変異体を作成した。2)細胞性粘菌のミオシンの頭部のATPase活性に関与する部位の一部を欠損させた遺伝子をミオシン欠損変異体に導入した。この変異細胞は、ミオシン欠損変異体と同じように細胞分裂ができなかった。3)これらの変異体の細胞を微分干渉顕微鏡を用いて、ビデオカメラで取得後、コンピューターによる画像解析により、各リン酸化欠損に伴う細胞の行動や細胞内顆粒の動きの異常を解析した。また、細胞内のミオシン分子の挙動を直接観察するため、蛍光標識したモノクローナル抗ミオシン抗体Fabフラグメントを、エレクトロポレーション法により細胞内に導入して超高感度テレビカメラにより画像取得した。どの変異細胞においても分裂溝への改変ミオシンの局在が観察できた。このことはリン酸化もATPase活性もミオシンが分裂溝に局在するのに必須ではないことを示唆している。4)ATPase活性をもたないミオシンでは細胞内に繊維が観察された。この繊維は中間期の細胞ではほとんど動かないが、分裂に際して正常なミオシンと同じ速度で分裂溝に集合した。

1)Cellular myxomycetes have different types of non-muscle cells, and they are similar, re-locked, and regulated. The residue in the C terminal is the same as that in the C terminal. The amino acid residues of the amino acid residues. Three different kinds of acid are used in the first place. (1)The relocation-related residues are replaced by the relocation-related residues. This is the first time I've ever seen a woman. (2)The re-lock and the adjustment of the lock are combined with the transmission of the key element. This change in position will result in the adjustment of the lock. (3)In addition to the above, the company also has the ability to make changes to its products. 2)A part of the cellular myxomycetes involved in ATPase activity in the head was deficient in DNA, and a part of the DNA was deficient in DNA. The cell division of different species is different from that of different species. 3) Analysis of abnormal cellular activity and intracellular particle movement by differential microscope after acquisition of abnormal cellular activity and intracellular particle movement. The direct detection of intracellular molecular movements by light labeling and the detection of intracellular ultra-high-sensitivity antibody Fab fragments by light labeling are described in detail below. In the middle of the cell division, the cell division channel is changed, and the cell division is changed. The enzyme activity of this enzyme is dependent on the activity of the enzyme. 4)ATPase activity was detected in the intracellular membrane. The cells in the intermediate phase of the cell cycle are divided into normal cells and at the same speed.