遺伝子改変による非筋細胞ミオシンの機能解析

通过基因修饰对非肌肉细胞肌球蛋白进行功能分析

• 批准号: 08680768
• 负责人: 祐村 恵彦
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Yamaguchi University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08680768/
• 关键词: エレクトロポレーション; ミオシン; 細胞性粘菌; リン酸化

1)細胞性粘菌のミオシンは他の多くの非筋細胞と同様、重鎖および調節軽鎖がリン酸化を受ける。ミオシン重鎖のリン酸化はC末に近い3つのスレオニン残基で起こる。また、軽鎖のリン酸化は1つのセリン残基で起こる。これらのリン酸化が起こらない次の3種の変異体を用いた。(1)重鎖のリン酸化されるスレオニン残基をすべてセリン残基に置換した遺伝子をミオシン重鎖欠損変異体に導入したもの。この改変ミオシンでは重鎖のリン酸化は起こらない。(2)重鎖の調節軽鎖結合ドメインを欠いた遺伝子を導入したもの。この改変ミオシンでは、調節軽鎖を持たず軽鎖リン酸化による調節を受けない。(3)さらに、両者を欠損させた重鎖、軽鎖ともリン酸化がまったく起こらない変異体を作成した。2)細胞性粘菌のミオシンの頭部のATPase活性に関与する部位の一部を欠損させた遺伝子をミオシン欠損変異体に導入した。この変異細胞は、ミオシン欠損変異体と同じように細胞分裂ができなかった。3)これらの変異体の細胞を微分干渉顕微鏡を用いて、ビデオカメラで取得後、コンピューターによる画像解析により、各リン酸化欠損に伴う細胞の行動や細胞内顆粒の動きの異常を解析した。また、細胞内のミオシン分子の挙動を直接観察するため、蛍光標識したモノクローナル抗ミオシン抗体Fabフラグメントを、エレクトロポレーション法により細胞内に導入して超高感度テレビカメラにより画像取得した。どの変異細胞においても分裂溝への改変ミオシンの局在が観察できた。このことはリン酸化もATPase活性もミオシンが分裂溝に局在するのに必須ではないことを示唆している。4)ATPase活性をもたないミオシンでは細胞内に繊維が観察された。この繊維は中間期の細胞ではほとんど動かないが、分裂に際して正常なミオシンと同じ速度で分裂溝に集合した。

1）像许多其他非肌肉细胞一样，肌球蛋白是一种细胞粘液霉菌，在其沉重和调节的光链中被磷酸化。肌球蛋白重链的磷酸化发生在C末端附近的三个苏氨酸残基上。轻链磷酸化也发生在单个丝氨酸残基处。使用了这些磷酸化中未发生的三个突变体。 （1）将重链的所有磷酸化苏氨酸残基被丝氨酸残基取代的基因被引入肌球蛋白重链缺乏突变体中。这种修饰的肌球蛋白不会引起重链磷酸化。 （2）引入了缺少重链的调节轻链结合结构域的基因。这种修饰的肌球蛋白没有调节轻链，也不由轻链磷酸化调节。 （3）此外，创建了一个突变体，该突变体在具有缺陷的重链或轻链中根本没有磷酸化。 2）在细胞粘液霉菌肌球蛋白头部缺少参与ATPase活性的位点的基因被引入肌球蛋白缺陷型突变体中。该突变细胞无法像缺乏肌球蛋白的突变体那样分裂细胞。 3）使用摄像机使用差分干扰显微镜获得这些突变体的细胞，然后通过计算机图像分析分析了与每种磷酸化缺陷相关的细胞行为和细胞内颗粒的运动异常。此外，为了直接观察细胞内肌球蛋白分子的行为，通过电穿孔引入了荧光标记的单克隆抗肌球蛋白抗体Fab片段，并使用超高敏感性电视摄像头对细胞进行了成像。在所有突变细胞中都观察到了修饰的肌球蛋白的定位到有丝分裂凹槽。这表明磷酸化和ATPase活性对于肌球蛋白本地裂变凹槽都不是必不可少的。 4）在没有ATPase活性的肌球蛋白中观察到纤维。纤维几乎不会在相间细胞中移动，但是在分裂时，它们以与正常肌球蛋白相同的速率组装在裂变凹槽中。