生細胞内直視実験系による収縮環形成時のミオシンの動的構築機構解析

利用活细胞直接观察实验系统分析收缩环形成过程中肌球蛋白的动态组装机制

基本信息

批准号：
08259208
负责人：
祐村恵彦
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Yamaguchi University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08259208/
关键词：
ミオシン収縮環 ATP 細胞性粒菌

项目摘要

1)収縮環形成時のミオシン繊維の動的構築の観察。ミオシン繊維を生きた細胞内で観察するため、蛍光標識粘菌ミオシンをエレクトロポレーション法で細胞内に導入した。低温下に細胞を置くことで、ミオシン繊維の運動速度を下げて超高感度カメラにより観察した。細胞分裂時にミオシン繊維が収縮環に集まる際の素過程をはじめて観察した。2)ケージド蛍光色素標識によるミオシン分子の収縮環部位でのターンオーバー速度の解析。ケージド蛍光色素標識したミオシンを細胞内に導入し、細胞の一部に解除光を照射して、その部位に存在するケージド蛍光色素を解除し、その蛍光の拡散速度からミオシン分子のターンオーバー速度や分子の運動速度を計測することを試みるため、ケージド蛍光色素標識の条件を決定しようとしたが、ミオシンのATPase活性が失われてしまうため、標識試薬の選択から検討すべきである。ケージド蛍光色素標識したBSAは対象実験として導入に成功した。BSAは1-2秒で細胞内を拡散移動できることがわかった。3)ミオシンのリン酸化部位改変による細胞質分裂機構の解析。ミオシンのリン酸化部位をリン酸化されないアラニンに改変した遺伝子をミオシンを欠損する細胞に導入した変異細胞を用いた。これらの変異細胞のすべてで細胞質分裂の際にミオシンが収縮環を形成した。この発見は、従来の仮説に矛盾する結果となった。4)セミインビトロ系を用いた実験系による収縮環へのミオシン局在化機構の検討。分裂時の細胞から細胞膜と収縮環の複合体を得た。これに含まれるミオシンのリン酸化の状態、またミオシンがATP処理で膜から放出される際のリン酸化の有無について調べた。

1）在收缩环形成过程中观察肌球蛋白纤维的动态构造。为了观察活细胞中的肌球蛋白纤维，通过电穿孔引入荧光标记的粘液霉菌肌球蛋白。通过将细胞放置在低温下，使用超敏感相机降低并观察到肌球蛋白纤维的运动速度。首次观察到肌球蛋白纤维在细胞分裂过程中聚集在收缩环中的主要过程。 2）分析通过笼荧光染料标记的肌球蛋白分子收缩环部位的周转率。为了将笼子染料标记的肌球蛋白引入细胞中，用释放的光照射部分，释放出存在于该位置的笼荧光染料，并测量肌球蛋白分子的转离速率以及分子的运动速率以及分子的运动速率，并根据cloorescent Light的clusive for clive for cliperion的活性，我们已经尝试了cavient for的活动。丢失，应考虑选择标记试剂的选择。笼荧光染料标记的BSA成功引入了目标实验。发现BSA可以在1-2秒内扩散并在细胞内迁移。 3）通过改变肌球蛋白磷酸化位点来分析细胞力学机制。使用突变细胞，其中将肌球蛋白磷酸化位点修饰为未被磷酸化的丙氨酸变成缺乏肌球蛋白的细胞。在所有这些突变细胞中，肌球蛋白在细胞因子过程中形成收缩环。这一发现与常规假设相矛盾。 4）检查使用半体外系统实验系统将肌球蛋白定位到收缩环的定位机理。细胞膜和收缩环复合物是从分裂细胞中获得的。我们研究了其中包含的肌球蛋白的磷酸化状态，以及通过ATP处理从膜上释放时是否磷酸化。