生細胞内直視実験系による収縮環形成時のミオシンの動的構築機構解析

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1)収縮環形成時のミオシン繊維の動的構築の観察。ミオシン繊維を生きた細胞内で観察するため、蛍光標識粘菌ミオシンをエレクトロポレーション法で細胞内に導入した。低温下に細胞を置くことで、ミオシン繊維の運動速度を下げて超高感度カメラにより観察した。細胞分裂時にミオシン繊維が収縮環に集まる際の素過程をはじめて観察した。2)ケージド蛍光色素標識によるミオシン分子の収縮環部位でのターンオーバー速度の解析。ケージド蛍光色素標識したミオシンを細胞内に導入し、細胞の一部に解除光を照射して、その部位に存在するケージド蛍光色素を解除し、その蛍光の拡散速度からミオシン分子のターンオーバー速度や分子の運動速度を計測することを試みるため、ケージド蛍光色素標識の条件を決定しようとしたが、ミオシンのATPase活性が失われてしまうため、標識試薬の選択から検討すべきである。ケージド蛍光色素標識したBSAは対象実験として導入に成功した。BSAは1-2秒で細胞内を拡散移動できることがわかった。3)ミオシンのリン酸化部位改変による細胞質分裂機構の解析。ミオシンのリン酸化部位をリン酸化されないアラニンに改変した遺伝子をミオシンを欠損する細胞に導入した変異細胞を用いた。これらの変異細胞のすべてで細胞質分裂の際にミオシンが収縮環を形成した。この発見は、従来の仮説に矛盾する結果となった。4)セミインビトロ系を用いた実験系による収縮環へのミオシン局在化機構の検討。分裂時の細胞から細胞膜と収縮環の複合体を得た。これに含まれるミオシンのリン酸化の状態、またミオシンがATP処理で膜から放出される際のリン酸化の有無について調べた。