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ヒスチジン脱炭酸酵素における小胞体への翻訳後ターゲティングの調節機構

组氨酸脱羧酶翻译后靶向内质网的调控机制

基本信息

批准号：
11153210
负责人：
市川厚
金额：
$ 1.54万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

本年度の研究実施計画に基づき、以下の研究成果を得た。1.翻訳後ターゲティングの調節機構の解析:[^<35>S]メチオニン標識ヒスチジン脱炭酸酵素(HDC)を調製し、細胞質成分と反応させて標識HDCのイヌ膵臓ミクロソーム膜への移行を検討した。その結果、HDCの移行反応にATPの加水分解反応が必要であることがわかった。また、抗Hsc70抗体を用いての免疫沈降実験により、HDCの移行反応に熱ショック蛋白のHsc70が関与していることを明らかにした。2.小胞体移行シグナルの同定:すでに、これまでの実験で、小胞体移行におけるHDCのC-末端鎖の関与を明らかにしている。本年は、C-末端鎖の移行シグナルを有するドメインが、C-末端鎖の588番目から607番目までの20アミノ酸残基であることを明らかにした。さらに、このドメインを含むC-末端鎖ペプチドをGFP融合タンパクとして作成し、蛍光抗体法により細胞観察を行うことにより、20アミノ酸残基を含むC-末端鎖ドメインが小胞体に移行することを確認した。3.翻訳後ターゲティングに関与する分子シャペロンの検索:GST融合タンパクを用いたpull-down assay法により、ラット好塩基球細胞株RBL-2H3の細胞質から、HDCのC-末端鎖ドメインに結合する2種類のタンパク質(分子量70kDaおよび60kDa)を見出した。さらに、HDCのC末端鎖ペプチドから小胞体移行シグナルである20アミノ酸残基を除くと、上記2種類のタンパク質の示す結合活性は消失することを明らかにした。

This year's research implementation plan is based on the following research results. 1. Analysis of the regulatory mechanism of the post-conversion process:[^<35>S] identification of the process of decarboxylase (HDC) modulation, cytoplasmic composition and reverse transcription identification of HDC process and membrane migration. As a result, HDC's migration reaction to ATP is necessary. In addition, it has become clear that Hsc70 is involved in the migration reaction of HDC due to immune sedimentation using anti-Hsc70 antibodies. 2. The identity of the cell migration group: the C-terminal lock of the HDC and the C-terminal lock of the HDC This year, the C-terminal lock has 588 amino acid residues and 607 amino acid residues. In addition, the protein contains a C-terminal lock, GFP fusion protein is prepared, and the protein is detected by light antibody method. 3. Two kinds of proteins (molecular weight 70kDa to 60kDa) were found in the cytoplasm of RBL-2H3 cell line and in the C-terminal region of HDC by pull-down assay. In addition, the C-terminal lock of HDC was removed from the 20-amino acid residue, and the binding activity of the 2 species of HDC was eliminated.