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タンパク導入法を用いた遺伝子欠損の実験的治療

使用蛋白质转移方法实验性治疗基因缺陷

基本信息

批准号：
12877027
负责人：
仲野徹
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12877027/
关键词：
protein transduction TAT融合タンパク始原生殖細胞 Cre germ cell-less(gcl)

项目摘要

HIVのTATタンパクのアミノ末端11残基を任意のタンパクのアミノ末端に融合し、そのタンパクを細胞内に導入するという、protein transduction法が開発された。この方法を用いて、遺伝子欠損を実験的に治療する基礎的研究を、マウスの始原生殖細胞(PGC:primordial germ cells)の初代培養系を用いて行った。下に述べる結果のように、残念ながら、当初期待したような成果を得ることはできなかった。我々は、マウスPGCに遺伝子を一過的に導入するために、様々な遺伝子導入法を用いて条件検討を行っが、導入効率がよく、かつ細胞障害性の少ない方法を見出すことができなかった。そこで、protein transduction法がPGCにおいて有効かどうかを、レポーターとしてTAT-β-galactosidaseを用いることにより検討した。その結果、ほぼ100%のPGCがβ-galactosidaseの酵素活性を示し、細胞毒性もほとんど認めらなかったことから、マウスPGCにおいてもprotein transduction法の有用性が示された。次に、組換えタンパクCreとショウジョウバエにおいてPGCの形成に必須であるgerm cell-less(gcl)のマウス・ホモログについてTAT融合タンパクを作製しタンパク導入を試みた。しかし、TAT-Cre、TAT-gclともに大腸菌において発現させると細胞毒性を示した。培養条件、タンパク誘導の条件を検討したが改善せず、in vitroにおける大量タンパク発現系も行ったが、必要量のタンパクを得ることができなかった。TAT-Creについては、トランスフェクトしたレポーター・プラスミドにおいて組換えを誘導することから機能的なTAT融合タンパクができていることが示されたが、精製できる量が少ないので内在性の遺伝子における組換えは認められなかった。

The terminal 11 residues of HIV's TAT code are any of the following: Terminal fusion, そのタンパクをIntracellular introduction, するという, protein The method of transduction is open to the public. The method is based on the basic research on the use of いて and the use of いて line of the primary culture system of primordial germ cells (PGC: primordial germ cells). The following is the result of the result of the story, the regret of the memory, and the result of the original expectation of the story. I'm using the conditions for importing the するために and using the いて conditions for the にるためにに,マウスPGCに伝子を.検椒行っが, introduction efficiency がよく, かつ cytotoxicity の小ない method すことができなかった.そこで、protein The transduction method is effective when using PGC, and when using TAT-β-galactosidase, it is effective.そのResults, ほぼ100%のPGCがβ-galactosidase enzyme activity indicator , Cytotoxicity もほとんど recognized めらなかったことから, マウスPGC においてもprotein The usefulness of the transduction method is demonstrated. Time, group replacement, Creation, Creation, PGC formation is a must, Germ cell-less (gcl) のマウス・ホモログについてTAT fusion タンパクをproduced しタンパク imported をtrialみた.しかし, TAT-Cre, TAT-gcl ともに coliform において発 appear させるとcytotoxicity をshow した. Culture conditions, conditions for induction of タンパク, improvement of conditions, in A large amount of in vitro タンパク発 is now a も行ったが, and a necessary amount of のタンパクをget ることができなかった. TAT-Creについては、トランスフェクトしたレポーター・プラスミドにおいて组えをinducing することからfunctional なTAT Fusion of タンパクができていることがshows されたが, refined できるquantity小ないのでInternal natureの伝子における group changes えはcognizeめられなかった.