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タンパク導入法を用いた遺伝子欠損の実験的治療

使用蛋白质转移方法实验性治疗基因缺陷

基本信息

批准号：
12877027
负责人：
仲野徹
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12877027/
关键词：
protein transduction TAT融合タンパク始原生殖細胞 Cre germ cell-less(gcl)

项目摘要

HIVのTATタンパクのアミノ末端11残基を任意のタンパクのアミノ末端に融合し、そのタンパクを細胞内に導入するという、protein transduction法が開発された。この方法を用いて、遺伝子欠損を実験的に治療する基礎的研究を、マウスの始原生殖細胞(PGC:primordial germ cells)の初代培養系を用いて行った。下に述べる結果のように、残念ながら、当初期待したような成果を得ることはできなかった。我々は、マウスPGCに遺伝子を一過的に導入するために、様々な遺伝子導入法を用いて条件検討を行っが、導入効率がよく、かつ細胞障害性の少ない方法を見出すことができなかった。そこで、protein transduction法がPGCにおいて有効かどうかを、レポーターとしてTAT-β-galactosidaseを用いることにより検討した。その結果、ほぼ100%のPGCがβ-galactosidaseの酵素活性を示し、細胞毒性もほとんど認めらなかったことから、マウスPGCにおいてもprotein transduction法の有用性が示された。次に、組換えタンパクCreとショウジョウバエにおいてPGCの形成に必須であるgerm cell-less(gcl)のマウス・ホモログについてTAT融合タンパクを作製しタンパク導入を試みた。しかし、TAT-Cre、TAT-gclともに大腸菌において発現させると細胞毒性を示した。培養条件、タンパク誘導の条件を検討したが改善せず、in vitroにおける大量タンパク発現系も行ったが、必要量のタンパクを得ることができなかった。TAT-Creについては、トランスフェクトしたレポーター・プラスミドにおいて組換えを誘導することから機能的なTAT融合タンパクができていることが示されたが、精製できる量が少ないので内在性の遺伝子における組換えは認められなかった。

HIV TAT protein transfer method was developed by fusion of the terminal 11 residues of HIV TAT protein transfer. This method was applied to basic research on treatment of genetic defects and to primary culture lines of primordial germ cells (PGC). The results of the next two years, the residual thoughts, the original expectations, the results, the results, The introduction method of PGC gene is discussed in the condition, the introduction efficiency is improved, and the cell barrier is reduced. The protein transduction method is used for PGC. The results showed that 100% of PGC was associated with β-galactosidase enzyme activity, cytotoxicity, and the usefulness of the PGC protein transduction method. In order to form PGC, it is necessary to have germ cell-less(gcl) and TAT fusion. TAT-Cre, TAT-gcl, and E. coli were found to be cytotoxic. Culture conditions, conditions for induction, and the development of a large number of plants in vitro are discussed. TAT-Cre is a combination of TAT fusion and induction functions. It is a combination of TAT fusion and induction functions. It is a combination of TAT fusion and induction functions.