タンパク導入法を用いた遺伝子欠損の実験的治療

使用蛋白质转移方法实验性治疗基因缺陷

基本信息

批准号：
12877027
负责人：
仲野徹
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12877027/
关键词：
protein transduction TAT融合タンパク始原生殖細胞 Cre germ cell-less(gcl)

项目摘要

HIVのTATタンパクのアミノ末端11残基を任意のタンパクのアミノ末端に融合し、そのタンパクを細胞内に導入するという、protein transduction法が開発された。この方法を用いて、遺伝子欠損を実験的に治療する基礎的研究を、マウスの始原生殖細胞(PGC:primordial germ cells)の初代培養系を用いて行った。下に述べる結果のように、残念ながら、当初期待したような成果を得ることはできなかった。我々は、マウスPGCに遺伝子を一過的に導入するために、様々な遺伝子導入法を用いて条件検討を行っが、導入効率がよく、かつ細胞障害性の少ない方法を見出すことができなかった。そこで、protein transduction法がPGCにおいて有効かどうかを、レポーターとしてTAT-β-galactosidaseを用いることにより検討した。その結果、ほぼ100%のPGCがβ-galactosidaseの酵素活性を示し、細胞毒性もほとんど認めらなかったことから、マウスPGCにおいてもprotein transduction法の有用性が示された。次に、組換えタンパクCreとショウジョウバエにおいてPGCの形成に必須であるgerm cell-less(gcl)のマウス・ホモログについてTAT融合タンパクを作製しタンパク導入を試みた。しかし、TAT-Cre、TAT-gclともに大腸菌において発現させると細胞毒性を示した。培養条件、タンパク誘導の条件を検討したが改善せず、in vitroにおける大量タンパク発現系も行ったが、必要量のタンパクを得ることができなかった。TAT-Creについては、トランスフェクトしたレポーター・プラスミドにおいて組換えを誘導することから機能的なTAT融合タンパクができていることが示されたが、精製できる量が少ないので内在性の遺伝子における組換えは認められなかった。

已经开发了一种蛋白质转移方法，其中HIV的TAT蛋白的11个氨基末端残基融合到任何蛋白质的氨基末端，并将蛋白质引入细胞中。使用这种方法，使用原始生殖细胞（PGC）的原代培养系统进行了实验治疗基因缺陷的基础研究。不幸的是，如下所述，我们无法实现我们最初希望的结果。我们使用各种基因转移方法研究了这些条件，以便将基因暂时引入小鼠PGC，但无法找到有效的转导方法，几乎没有细胞毒性。因此，我们研究了通过使用Tat-β-半乳糖苷酶作为记者的蛋白质转移方法在PGC中是否有效。结果，几乎100％的PGC显示出β-半乳糖苷酶的酶活性，几乎没有细胞毒性，表明蛋白质转移方法在小鼠PGC中的有用性。接下来，我们为小鼠同源物的无生殖细胞（GCL）制备了TAT融合蛋白，这对于在重组蛋白CRE和果蝇中形成PGC至关重要，并试图引入蛋白质。但是，TAT-CRE和TAT-GCL均以大肠杆菌和细胞毒性表达。研究了培养条件和蛋白质诱导条件，但没有改善改善，尽管还在体外进行了质量蛋白表达系统，但仍无法获得所需的蛋白质。关于TAT-CRE，在转染的报告基因质粒中诱导了重组，表明形成了功能性TAT融合蛋白，但是由于纯化量很小，因此观察到内源性基因中的重组。