マトリックスメタロプロテアーゼを過剰発現するトランスジェニックウサギモデルの開発:動脈硬化病変(プラーク)の安定化に及ぼすMMP―12の影響について

マトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)は金属依存性の細胞外マトリックス分解酵素であり、ヒトでは現在までに30種類以上のMMP分子が存在することが明らかとなっている。MMPは細胞外基質を分解することにより動脈硬化、リュウマチ関節炎、肺気腫,ガン転移などの発生に重要な役割を果たしていると考えられている。我々はエラスターゼ活性を持つマクロファージメタロエラスターゼ(MMP-12)の動脈硬化の発生及び進展における役割に着目して、動脈硬化巣におけるMMP-12の発現と局在について病理学的並びに細胞生物学的な検討を行ってきた。本研究では、動脈硬化やリウマチ関節炎、肺気腫などの炎症疾患の発生におけるMMP-12の役割をin vivoで解明することを目的として、ヒトMMP-12を過剰発現するトランスジェニック(Tg)ウサギ・モデルの開発を試みた。本年度はMMP-12トランスジェニックウサギを用いた実験を行い、以下の結果が得られた。MMP12Tgウサギより得られたF1ウサギを用いて、肺胞Mφ及び腹腔内MφからmRNAを抽出し、ヒトMMP-12に対する特異的なプライマーでRT-PCRを行った結果、ヒトMMP-12はMφのみで特異的に発現していることが判明した。ヒトMMP-12の蛋白質を測定するために、ウサギの腹腔内Mφを無血清培地で24時間培養して培養上清を調製した。また、Mφを活性化するためPMAを添加した無血清培地で24時間培養した後の培養上清も調製した。これらの培養上清を10%ポリアクリルアミドゲルで電気泳動後に抗ヒトMMP-12抗体でウェスタンブロットしたところ、PMAで活性化されたTgウサギのMφからヒトMMP-12蛋白が分泌されていた。Zymographyでの解析により、分泌されたヒトMMP-12蛋白はβ-カゼインならびにエラスチンを分解出来ることが確認された。また、正常ウサギからのMφと比べ、トランスジェニックウサギのMφからのMMP-12の産生能が亢進していることが判明した。現在、トランスジェニックウサギ(オス8羽)及び正常ウサギ(オス8羽)に0.3%コレステロール食を負荷させて動脈硬化発生及びプラーグの形成に及ぼすMMP-12の影響について検討中である。また、Carageenanの注入によるウサギの炎症性関節炎モデルを作成し、炎症性疾患であるリュウマチ関節炎の病理学解析も行っている。

マトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)は金属依存性の細胞外マトリックス分解酵素であり、ヒトでは現在までに30種類以上のMMP分子が存在することが明らかとなっている。MMPは細胞外基質を分解することにより動脈硬化、リュウマチ関節炎、肺気腫,ガン転移などの発生に重要な役割を果たしていると考えられている。我々はエラスターゼ活性を持つマクロファージメタロエラスターゼ(MMP-12)の動脈硬化の発生及び進展における役割に着目して、動脈硬化巣におけるMMP-12の発現と局在について病理学的並びに細胞生物学的な検討を行ってきた。本研究では、動脈硬化やリウマチ関節炎、肺気腫などの炎症疾患の発生におけるMMP-12の役割をin vivoで解明することを目的として、ヒトMMP-12を過剰発現するトランスジェニック(Tg)ウサギ・モデルの開発を試みた。本年度はMMP-12トランスジェニックウサギを用いた実験を行い、以下の結果が得られた。MMP12Tgウサギより得られたF1ウサギを用いて、肺胞Mφ及び腹腔内MφからmRNAを抽出し、ヒトMMP-12に対する特異的なプライマーでRT-PCRを行った結果、ヒトMMP-12はMφのみで特異的に発現していることが判明した。ヒトMMP-12の蛋白質を測定するために、ウサギの腹腔内Mφを無血清培地で24時間培養して培養上清を調製した。また、Mφを活性化するためPMAを添加した無血清培地で24時間培養した後の培養上清も調製した。これらの培養上清を10%ポリアクリルアミドゲルで電気泳動後に抗ヒトMMP-12抗体でウェスタンブロットしたところ、PMAで活性化されたTgウサギのMφからヒトMMP-12蛋白が分泌されていた。Zymographyでの解析により、分泌されたヒトMMP-12蛋白はβ-カゼインならびにエラスチンを分解出来ることが確認された。また、正常ウサギからのMφと比べ、トランスジェニックウサギのMφからのMMP-12の産生能が亢進していることが判明した。現在、トランスジェニックウサギ(オス8羽)及び正常ウサギ(オス8羽)に0.3%コレステロール食を負荷させて動脈硬化発生及びプラーグの形成に及ぼすMMP-12の影響について検討中である。また、Carageenanの注入によるウサギの炎症性関節炎モデルを作成し、炎症性疾患であるリュウマチ関節炎の病理学解析も行っている。