NADPHオキシダーゼコンポーネントp47^<phox>のSH3Aドメインの構造解析 ―部位特異的スピンラベル法と飽和移動法による研究―

NADPHオキシダーゼは好中球に存在し、スーパーオキサイドを生成する酵素として知られている。このNADPHオキシダーゼは感染防御にとって非常に重要であると認識されており、細胞膜に局在するp22^<phox>とgp91^<phox>、細胞質に局在するp47^<phox>、p67^<phox>ならびにracから構成されることが知られている。活性化に際しては、FcRやFMLP刺激によって活性化したprotein kinase C(PKC)がp47^<phox>のC末端領域のリン酸化を促し、リン酸化p47^<phox>の二つのSH3ドメイン(SH3(N),SH3(C)とプロリンリッチ領域(PRR)が、それぞれp22^<phox>とp67^<phox>と結合し、膜に会合し、活性を表すと考えられている。本研究では、システイン残基をターゲットとした3-malemide-proxylをスピンプローブとして用いたスピンラベル法を用い、リン酸化に伴うp47^<phox>の構造変化を解析した。wild typep47^<phox>のESRスペクトルはラベルされたN-oxylの早い運動を示すunimmobilizedコンポーネントと運動の抑制を示すimmobilizedコンポーネントが観察された。C378Aの変異蛋白ではunimmobilizedコンポーネントのみが消失した。またC196Aの変異蛋白質ではimmobilizedコンポーネントが消失した。このことから、unimmobilizedコンポーネントはC379に由来し、C末端付近のSH3(C)ドメイン付近の構造変化に起因することが推察された。またimmobilizedコンポーネントはC196に由来し、SH3(N)ドメイン付近の構造変化に由来することを示唆している。また、unimmobilizedコンポーネントはPKCによりリン酸化されることにより運動性が抑制されることが明らかとなった。飽和移動法を用いることで、リン酸化でさらに運動性の抑制が観察された。以上の結果より、SH3(C)ならびにSH3(N)は、リン酸化で、共にrigidな構造変化を起こしており、これが、NADPHオキシダーゼ活性化のためのシグナル伝達に重要であることが示唆された。

NADPHオキシダーゼは好中球に存在し、スーパーオキサイドを生成する酵素として知られている。このNADPHオキシダーゼは感染防御にとって非常に重要であると認識されており、細胞膜に局在するp22^<phox>とgp91^<phox>、細胞質に局在するp47^<phox>、p67^<phox>ならびにracから構成されることが知られている。活性化に際しては、FcRやFMLP刺激によって活性化したprotein kinase C(PKC)がp47^<phox>のC末端領域のリン酸化を促し、リン酸化p47^<phox>の二つのSH3ドメイン(SH3(N),SH3(C)とプロリンリッチ領域(PRR)が、それぞれp22^<phox>とp67^<phox>と結合し、膜に会合し、活性を表すと考えられている。本研究では、システイン残基をターゲットとした3-malemide-proxylをスピンプローブとして用いたスピンラベル法を用い、リン酸化に伴うp47^<phox>の構造変化を解析した。wild typep47^<phox>のESRスペクトルはラベルされたN-oxylの早い運動を示すunimmobilizedコンポーネントと運動の抑制を示すimmobilizedコンポーネントが観察された。C378Aの変異蛋白ではunimmobilizedコンポーネントのみが消失した。またC196Aの変異蛋白質ではimmobilizedコンポーネントが消失した。このことから、unimmobilizedコンポーネントはC379に由来し、C末端付近のSH3(C)ドメイン付近の構造変化に起因することが推察された。またimmobilizedコンポーネントはC196に由来し、SH3(N)ドメイン付近の構造変化に由来することを示唆している。また、unimmobilizedコンポーネントはPKCによりリン酸化されることにより運動性が抑制されることが明らかとなった。飽和移動法を用いることで、リン酸化でさらに運動性の抑制が観察された。以上の結果より、SH3(C)ならびにSH3(N)は、リン酸化で、共にrigidな構造変化を起こしており、これが、NADPHオキシダーゼ活性化のためのシグナル伝達に重要であることが示唆された。