ゲノム再編成の制御機構

基因组重排的控制机制

基本信息

批准号：
13206017
负责人：
名川文清
金额：
$ 3.84万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13206017/
关键词：
V(D)J組み換え抗原受容体遺伝トランスポゾン RAG リン酸化

项目摘要

V(D)J組み換えは、脊椎動物の進化の過程で抗原受容体遺伝子に偶然挿入されたトランスポゾンの切り出し反応を利用したものと考えられており、実際組換え酵素であるRAGタンパク質によって切り出されたsignal-end(SE)がin vitroではトランスポーズすることが知られている。我々は、SEDNAの3'-OH端が、RAGタンパクと形成するSE complex中でリン酸化されていることを最近発見した。このリン酸化は切断後のSEがトランスポーズするのを阻害する。本研究では、この3'-リン酸化の反応機構を明らかにすることを目指しin vitroで解析を進めた。その結果、3'突出末端を持つ二本鎖DNAが基質となってss/ds junctionが切断され、その3'端に生じたリン酸基がSEDNAの3'-OH端に転移することが判明した。3'リン酸基を持つドナーDNAは、そのリン酸基によってSE complexに特異的に取り込まれていることがDNaseIフットプリント法により確認され、転移反応の結果リン酸基を失い3'-OHとなったドナーDNAは、SE complexからすみやかに解離することが明らかとなった。さらに、ドナーDNAの取り込みにRAG1タンパク質が重要な役割を果たしていることが、変異体を用いた解析から明らかとなった。in vivoでは、hairpin開裂後のコーディング末端に3'-突出構造が見られ、実際の組み換えではプロセスされたコーディング末端(CE)がリン酸基のドナーとなっている可能性が高いと考えられる。従って、我々が見いだした31リン酸基転移反応は、一方では挿入変異の原因となるSEのトランスポジションを抑止し、もう一方ではヘアピンの開裂、プロセスによってCEに生じた3'リン酸基を取り除いてligationを可能にするという、極めて重要な役割を果たしている可能性がある。

V（d）J的重组被认为是在脊椎动物进化过程中意外插入抗原受体基因中的转座子的切除反应，并且已知是由重组酶，RAG蛋白，RAG蛋白质，体外转poses中的重组酶（SE）切除的信号末端（SE）。我们最近发现，SEDNA的3'-OH端被与抹布蛋白形成的SE复合物磷酸化。这种磷酸化抑制了切割后SE的转座。在这项研究中，我们在体外进行了分析，旨在阐明这种3'-磷酸化的机制。结果，发现具有3'前端端的双链DNA变成了底物，SS/DS连接被切割，并且在SEDNA的3末端形成的磷酸组被转移到3'-OH END。 DNASEI足迹方法证实，磷酸盐组将具有3磷酸基团的供体DNA专门掺入SE复合物中，并且揭示了损失其磷酸基团并因转移反应而变为3'-OH的供体DNA，并且它很快与SE复合物相关。此外，使用突变体的分析表明，RAG1蛋白在供体DNA摄取中起重要作用。在体内，发夹裂解后的编码端可见一个3'-螺旋式结构，在实际重组中，处理后的编码端（CE）很可能是磷酸盐组的供体。因此，我们发现的转磷酸反应可能在防止SE的转座中起关键作用，这一方面是负责插入突变的，另一方面，允许发夹裂解，从而逐渐逐步消除了CE中的3'磷酸基团，从而逐步消除了结扎。