鳥類のZW型性決定機構のゲノム生物学的アプローチによる解析

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1)性決定、性分化に関与する性染色体上の遺伝子のcDNAマクロアレイによる検索:ニワトリの生殖腺分化は6日胚頃から観察される。これに先立つ4日胚の胚全体から雌マイナス雄サブトラクションcDNAライブラリーを作製し、その約5000クローンをマクロアレイ化した(384クローン/アレイX13枚)。この全アレイを4日胚の雌マイナス雄cDNA,雄マイナス雌cDNA,Wpkci cDNA[Hori, T. et al., Mol. Biol. Cell 11:3645-3660(2000)]をそれぞれプローブとして検索し、雌特異的発現の著しい233クローンを選別した。これらのクローンをそれぞれ標識プローブとして、制限酵素消化した雌雄ニワトリゲノムDNAにサザンブロットハイブリダイゼーションを行い、そのパターンからW染色体由来と考えられる59クローンをさらに選別した、これらの全ての塩基配列を決定する予定であるが、現在まで10クローンの配列を決定し、塩基配列およびESTデータベースとの相同性検索を行い、4種の遺伝子、5種のニワトリEST配列、1つのWpkci pre-mRNA配列を同定した。現在、5日胚の生殖隆起+中腎からも同様のサブトラクションcDNAマクロアレイを作製中である。2)ニワトリの雄でZ染色体不活性化現象が存在するか否かの検証:ニワトリZ染色体上の5種の遺伝子(GHR,nAChRβ3,AldB,GT-1,IREBP)とコントロールとして常染色体上の遺伝子GAPDHを選び、それぞれのBACゲノムクローンを用いて、イントロン配列に対するジゴキシゲニン標識アンチセンスリボプローブを作製、それぞれの遺伝子を発現する雌雄の組織の細胞にDNAを変性しない条件下で蛍光in situハイブリダイゼーションを行い、pre-mRNAの局在を検出した。調べた全ての遺伝子で核内に2カ所のシグナルが認められ、これらはそれぞれの遺伝子の局在部位に相当したことから、1本のZ染色体がランダムに不活性化され、その上の大部分の遺伝子の転写が生じなくなるような現象は雄ニワトリでは存在しないと結論した(Kuroda, Y. et al., 2001)。3)ニワトリW染色体に特異的な新規の反復配列SspIファミリーの発見:0.5kb SspI配列単位が約14,000回縦列反復した反復配列がニワトリW染色体短腕の非ヘテロクロマチン末端との境界域に存在することを見いだした(Itoh, Y. et al., in preparation)。この結果、XhoIファミリー、EcoRIファミリーと合わせてW染色体上の反復配列は全体で約39Mbとなり、W染色体の全DNA量は約54Mbと推定されることから、非反復配列は約15Mbと推定される。約480kbの非反復配列クローンのコンテイグから1個のchSpin-W遺伝子が見いだされたこと(Itoh, Y., et al., 2001)を考えると、W染色体の非反復配列域には30個程度の遺伝子が存在すると推定される。