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鳥類のZW型性決定機構のゲノム生物学的アプローチによる解析

使用基因组生物学方法分析鸟类 ZW 型性别决定机制

基本信息

批准号：
13206071
负责人：
水野重樹
金额：
$ 3.52万
依托单位：
Nihon University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

1)性決定、性分化に関与する性染色体上の遺伝子のcDNAマクロアレイによる検索:ニワトリの生殖腺分化は6日胚頃から観察される。これに先立つ4日胚の胚全体から雌マイナス雄サブトラクションcDNAライブラリーを作製し、その約5000クローンをマクロアレイ化した(384クローン/アレイX13枚)。この全アレイを4日胚の雌マイナス雄cDNA,雄マイナス雌cDNA,Wpkci cDNA[Hori, T. et al., Mol. Biol. Cell 11:3645-3660(2000)]をそれぞれプローブとして検索し、雌特異的発現の著しい233クローンを選別した。これらのクローンをそれぞれ標識プローブとして、制限酵素消化した雌雄ニワトリゲノムDNAにサザンブロットハイブリダイゼーションを行い、そのパターンからW染色体由来と考えられる59クローンをさらに選別した、これらの全ての塩基配列を決定する予定であるが、現在まで10クローンの配列を決定し、塩基配列およびESTデータベースとの相同性検索を行い、4種の遺伝子、5種のニワトリEST配列、1つのWpkci pre-mRNA配列を同定した。現在、5日胚の生殖隆起+中腎からも同様のサブトラクションcDNAマクロアレイを作製中である。2)ニワトリの雄でZ染色体不活性化現象が存在するか否かの検証:ニワトリZ染色体上の5種の遺伝子(GHR,nAChRβ3,AldB,GT-1,IREBP)とコントロールとして常染色体上の遺伝子GAPDHを選び、それぞれのBACゲノムクローンを用いて、イントロン配列に対するジゴキシゲニン標識アンチセンスリボプローブを作製、それぞれの遺伝子を発現する雌雄の組織の細胞にDNAを変性しない条件下で蛍光in situハイブリダイゼーションを行い、pre-mRNAの局在を検出した。調べた全ての遺伝子で核内に2カ所のシグナルが認められ、これらはそれぞれの遺伝子の局在部位に相当したことから、1本のZ染色体がランダムに不活性化され、その上の大部分の遺伝子の転写が生じなくなるような現象は雄ニワトリでは存在しないと結論した(Kuroda, Y. et al., 2001)。3)ニワトリW染色体に特異的な新規の反復配列SspIファミリーの発見:0.5kb SspI配列単位が約14,000回縦列反復した反復配列がニワトリW染色体短腕の非ヘテロクロマチン末端との境界域に存在することを見いだした(Itoh, Y. et al., in preparation)。この結果、XhoIファミリー、EcoRIファミリーと合わせてW染色体上の反復配列は全体で約39Mbとなり、W染色体の全DNA量は約54Mbと推定されることから、非反復配列は約15Mbと推定される。約480kbの非反復配列クローンのコンテイグから1個のchSpin-W遺伝子が見いだされたこと(Itoh, Y., et al., 2001)を考えると、W染色体の非反復配列域には30個程度の遺伝子が存在すると推定される。

1) Sexual determination, sexual differentiation and the cDNA code on the sex chromosome: gonad differentiation on the 6th day of the embryo. All the embryos of the 4th day of pregnancy are produced by the female and male embryos. Made of approximately 5,000 クローンをマクロアレイ化した (384 クローン/アレイX13 pieces).この全アレイを4 day embryo の女マイナス male cDNA, male マイナス female cDNA, Wpkci cDNA [Hori, T. et al., Mol. Biol. Cell 11:3645-3660(2000)]をそれぞれプローブとして検素so, female-specific 発appearの出しい233クローンを选出した.これらのクローンをそれぞれLOGO プローブとして, restriction enzyme digestion した女andro ニワトリゲノムDNA にサザンブロットハイブリダイゼーションを行い、そのパターンかThe origin of the W chromosome and the selection of the 59-year-old chromosomeした、これらの全ての婩组arrayをdeterminationするpredeterminedであるが、Now まで10クローンのalignmentをdeterminationし、婩组arrayおよびESTデータベースとのidentity検SOを行い、4 kinds of の缝子、5 kinds of のニワトリEST arrangement、1つのWpkci The pre-mRNA alignment is consistent. Currently, the reproductive bulge + mesonephros on the 5th day of pregnancy are produced together with the cDNA DNA test. 2) Evidence of the existence of the phenomenon of inactivation of the male Z chromosome in the male and female Z chromosome: 5 types of inactivation of the male Z chromosome (G HR, nAChRβ3, AldB, GT-1, IREBP) GAPD on autosomal chromosomes Hを选び、それぞれのBACゲノムクローンを用いて、 The イントロンmatching に対するジゴキシゲニン logo アンチセンProduced by スリボプローブを, それぞれの伝子を発 appear, male and female tissues, cells, DNA, を変性しない, under the condition of light in situハイブリダイゼーションを行い, pre-mRNAのbureau in を検出した. Tune the full set of the remaining parts of the inner part of the inner part of the inner part of the inner part of the house.それぞれの缝子のlocality in the part is quite したことから, 1本のZ chromosome がランダムにInactivationされ、その上のmost partの缝子の転WRITEが生じなくなるようなphenomenonは男ニワトリではEXISTENCEしないとCONCLUSIONした(Kuroda, Y. et al., 2001). 3) ニワトリW chromosome に-specific new rule repeated arrangement SspI ファミリーの発See: 0.5kb SspI arranges the unitary position approximately 14,000 times, repeats the sequence, and repeats the arrangement. The W chromosome is short. Itoh, Y. et al., in preparation).このRESULTS, The amount of total DNA of the Tona and W chromosomes is approximately 54Mb and is estimated to be the same, and the non-repeating arrangement is approximately 15Mb and is estimated to be the same. Approximately 480kb of non-repeating array クローンのコンテイグから1のchSpin-W 缝子が见いだされたこと(Itoh, Y., et al., 2001) The existence of 30 non-repetitive alignment domains of W chromosomes and the existence of 30-degree non-repetitive alignment domains of W chromosomes have been estimated.