マウス胚性幹細胞を用いたジーントラップ法によるゲノム欠失型疾患モデルマウスの作出

利用小鼠胚胎干细胞利用基因捕获法创建基因组缺失疾病模型小鼠

• 批准号: 13780660
• 负责人: 宮下 哲典
• 金额: $ 1.41万
• 依托单位: Niigata University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13780660/
• 关键词: ゲノム; ES細胞; ジーントラップ

新規ジーントラップベクターの構築と機能確認マウス胚性幹(ES)細胞ゲノムに欠失(数kb〜数百kb)を引き起こすための新規ジーントラップベクターを4種類構築した(GT-a、-b、-c、-d)。レポーター遺伝子としてはLacZとEGFPを用い、薬剤耐性遺伝子としてはネオマイシン耐性遺伝子neoとハイグロマイシン耐性遺伝子Hygを用いた。Neo-LacZでセンス転写ユニット(IRESを介したdicistron)を成し、Hyg-EGFP(融合遺伝子)でアンチセンス転写ユニットを構成している。本研究では、シングルジーントラップのみならず、ダブルジーントラップも想定している。従って、上記4種類のベクターの1つ『GT-a』にはneo-LacZユニットとHyg-EGFPユニットのどちらにもプロモーターを付していない。『GT-b』〜『GT-d』は『GT-a』のコントロールベクターである。『GT-b』と『GT-c』については片方のユニットそれぞれにプロモーターを付けてあり、『GT-d』にはどちらのユニットにもプロモーターを付けてある。マウスES細胞へ遺伝子導入する前に、構築したベクターが細胞内できちんと機能するかどうかを調べるための実験を行った。ラットアストログリオーマ由来のC6細胞に、リポフェクション法によって一過性及び永久的にそれぞれ遺伝子導入した。その結果、『GT-b』『GT-c』のベクターを用いた実験から、センス及びアンチセンス転写ユニットはどちらも機能的であることが分かった。また、『GT-d』を用いた実験から、両ユニットが各プロモーターでダブルドライブされた場合にもセンス-アンチセンス転写ユニットは同時に独立して機能することが分かった。また、ノーザン解析、鎖特異的RT-PCR解析によっても、両ユニットの適切な転写を確認した。従って、本研究の遂行に必要なベクターの構築が確認され、レポーター遺伝子(LacZ、EGFP)や薬剤耐性遺伝子(neo、Hyg)が機能することが分かった。これらベクターを用いて実際にES細胞に遺伝子導入し、ゲノム欠失を伴った細胞株の樹立を目指す。

New regulation of embryonic stem (ES) cells requires four types of construction (GT-a, -b, -c, -d). The gene of LacZ and EGFP is used in the gene of LacZ and EGFP. The gene of LacZ and EGFP is used in the gene of LacZ and EGFP. Neo-LacZ (IRES), Hyg-EGFP (Fusion Gene), Neo-LacZ (IRES), Hyg-EGFP(Fusion Gene), Neo-LacZ (IRES), Hyg-EGFP(IRES), Hyg-EGFP(IRES), Hyg-EGFP, Hyg-EGFP. This study is aimed at determining the content of the drug and the drug content of the drug. 1 of the 4 categories of "GT-a" is neo-LacZ and Hyg-EGFP.『GT-b』〜『GT-d』は『GT-a』のコントロールベクターである。"GT-b" and "GT-c" are the most important parts of the film."GT-d" is the most important part of the film. Before the introduction of ES gene, the construction of ES gene was carried out. C6 cells were introduced into the cells by transient and permanent methods. The results of the game, the actual use of "GT-b" and "GT-c" events, and the functions of the game and the game are all different. In the case of "GT-d","," GT-d ",","," GT For example, the RT-PCR analysis, lock-specific RT-PCR analysis, and identification of the appropriate RT-PCR. In this study, the construction of the necessary vector was confirmed, and the function of the vector (LacZ, EGFP) and the vector (neo, Hyg) was identified. The introduction of ES cells into the system and the establishment of ES cell lines are indicated.

项目成果

Chika Kutuwada et al.: "Investigation of the transcription in C6 cells trapped by a novel gene trap vector of convergent type"Acta Medica et Biologica. 51-1(発表予定). (2003)

Chika Kutuwada 等人：“由聚合型新型基因捕获载体捕获的 C6 细胞中的转录的研究”Acta Medica et Biologica 51-1（待出版）。