細胞の接着・移動においてカドヘリン結合タンパク質p120が果たす役割の解析

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本年度はまず、p120遺伝子を破壊するためのターゲティングベクターおよび、HAタグ付p120を発現させるためのターゲティングベクターの作成を行った。ターゲティングベクターはすべてプルモータートラップ型である。通常のターゲティングベクターとノックインタイプ(遺伝子は破壊するがcDNAが挿入されるため遺伝子破壊後もHAタグ付のp120タンパク質の発現が残るタイプ)の発現ベクターを作成した。ターゲティングベクター、発現ベクターともloxP配列を挿入することにより、p120のcDNAや薬剤耐性遺伝子をCre処理により除去できるような工夫をした。F9細胞にノックアウトベクターを導入し一回目の遺伝子破壊を試み成功した。しかし、この時点で、p120遺伝子はF9細胞には3つ存在することが判明した(F9細胞はカリオタイプに乱れがあるため、いくつかの遺伝子は2nでなくなっていることが知られている。)同じベクターを導入して高濃度の薬剤で処理したところ2つ目のアリルも墓する事に成功した。しかし3つ目のアリルは原因は不明であるが今のところ破壊された細胞を得ることが出来ない。p120の欠損が細胞レベルで致死である可能性を考え、ノックインベクターで遺伝子破壊を試みた。その結果、相同組換えが生じた細胞を得ることは出来たが、複数とれた細胞すべてでcDNA内で相同組換えが生じていた。これらの細胞では内在性のp120分子の発現は見られないが、HAタグ付のp120の弱い発現が見られた。このp120低発現細胞ではカドヘリンの細胞接着部位への濃縮が減少し、細胞質に大きな顆粒として局在する事が分かった。この顆粒は一部エンドソームマーカーと一部ゴルジマーカーと局在を共にする。現在、p120発現低下で生じるEカドヘリンの細胞内局在変化の原因の究明と完全なp120遺伝子破壊細胞の単離を試みている。