ナノ帯電粒子-DNA複合体を用いた遺伝子トランジスタによる高感度遺伝子多型解析

平成19年度は、平成18年度に実施したナノ帯電粒子の利用によるDNA検出の再現性を調査し精度の高いDNAハイブリダイゼーションの検出が可能であることがわかった。さらに、ナノ帯電粒子-DNA複合体を組み合わせた遺伝子トランジスタによる一塩基多型(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)検出にライゲーションアッセイ法を利用する実験手法を確立した。ライゲーションアッセイ法では、サンドイッチアッセイによリターゲットDNAとハイブリダイゼーションしたDNAプローブと複合体DNA(レポーターDNA)をリガーゼ酵素により連結(ライゲーション)する。その際、DNAプローブは、ライゲーションする末端がSNPサイトとなるようにあらかじめ設計する必要がある。末端のSNPサイトがターゲットDNAと相補的である場合は、酵素反応によりレポーターDNAがDNAプローブとライゲーションされナノ帯電粒子-DNA複合体はゲート表面上に残る。そのため、ライゲーション反応後ターゲットDNAを解離するとゲート表面にナノ帯電粒子-DNA複合体が固定されたまま残る。一方、末端のSNPサイトがターゲットDNAと非相補的である場合は、ライゲーション反応が起きないため、ターゲットDNAが解離される際に同時にナノ帯電粒子-DNA複合体もゲート表面から取り除かる。このようにライゲーション反応の有無によるナノ帯電粒子-DNA複合体の電荷密度変化を半導体パラメーターアナライザー(4155C, Agilent)を用いてしきい値電圧(V_T)の変化として捉えることが可能となり、高感度のSNPタイピングの可能性が得られた。

平成19年度は、平成18年度に実施したナノ帯電粒子の利用によるDNA検出の再現性を調査し精度の高いDNAハイブリダイゼーションの検出が可能であることがわかった。さらに、ナノ帯電粒子-DNA複合体を組み合わせた遺伝子トランジスタによる一塩基多型(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)検出にライゲーションアッセイ法を利用する実験手法を確立した。ライゲーションアッセイ法では、サンドイッチアッセイによリターゲットDNAとハイブリダイゼーションしたDNAプローブと複合体DNA(レポーターDNA)をリガーゼ酵素により連結(ライゲーション)する。その際、DNAプローブは、ライゲーションする末端がSNPサイトとなるようにあらかじめ設計する必要がある。末端のSNPサイトがターゲットDNAと相補的である場合は、酵素反応によりレポーターDNAがDNAプローブとライゲーションされナノ帯電粒子-DNA複合体はゲート表面上に残る。そのため、ライゲーション反応後ターゲットDNAを解離するとゲート表面にナノ帯電粒子-DNA複合体が固定されたまま残る。一方、末端のSNPサイトがターゲットDNAと非相補的である場合は、ライゲーション反応が起きないため、ターゲットDNAが解離される際に同時にナノ帯電粒子-DNA複合体もゲート表面から取り除かる。このようにライゲーション反応の有無によるナノ帯電粒子-DNA複合体の電荷密度変化を半導体パラメーターアナライザー(4155C, Agilent)を用いてしきい値電圧(V_T)の変化として捉えることが可能となり、高感度のSNPタイピングの可能性が得られた。