Optical analysis of the oxygen-regulated assembly of hypoxia inducible factor-1 (HIF-1) by means of 2 photon laser FRET and FRAP

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Ziel des Projektes ist es, das Verständnis der hypoxieinduzierten Genexpression zu verbessern. Dazu soll die Kolokalisation des Transkriptionsfaktorkomplexes HIF-1 und der Koaktivatoren, die die Expression des Gens für Erythropoietin (EPO) unter hypoxischen Bedingungen steigern, in lebenden Zellen und intakten Zellkernen quantitativ optisch analysiert werden. Die lichtmikroskopische Lokalisation der Komponenten von HIF-1 erfolgt erst in den verschiedenen zellulären Kompartimenten und anschließend an regulatorischen DNA-Elementen des EPO-Gens unter einem definierten Sauerstoffdruck. Zudem sollen mithilfe der "Far Field Light Microscopy" jenseits der Grenzen der konventionellen optischen Auflösung aktives Chromatin und der aktive HIF-1-Komplex kolokalisiert werden. Die Kolokalisation der HIF-1 Komponenten durch 2-Photonen angeregte FRET-Messungen, um Abstände von wenigen nm zu bestimmen, wird kombiniert mit der "3D-2-Photonen Epifluorescence Spectral Precision Distance Microscopy" [SPDM], um größere Abstände zu bestimmen. Die Größe des Chromatinkomplexes, der das EPO-Gen in seinem aktiven und inaktiven Status beherbergt, wird mit "Spatially Modulated Illumination" Mikroskopie und Fluorescence in situ Hybridisierung mit EPO-Gen spezifischen Sonden bestimmt. Summary: The aim of the project is to gain further insight into hypoxia-induced gene expression. Hence, quantitative optical analyis of the co-localization of the transcription factor complex HIF-1 and co-activators increasing expression of the erythropoietin (EPO) gene under hypoxic conditions in living cells and fixed intact nuclei will be performed. Light optical analysis will be used to localize HIF-1 components in different cellular compartments and subsequent co-localization on regulatory DNA elements of the EPO gene under a defined oxygen tension. Furthermore, new Far Field Light Microscopy approaches beyond the limits of conventional optical resolution shall be applied to determine the colocalization of active chromatin and the active HIF-1 complex. For colocalization of HIF-1 components, Two-photon excitation FRET-measurements for the determination of small distances in the few nm range, and three-dimensional [3D] Two-photon epifluorescence Spectral Precision Distance Microscopy [SPDM] for the measurement of larger distances will be combined. The size (diameter) of the chromatin complex harboring the EPO gene in its active and inactive state will be determined by Spatially Modulated Illumination [SMI] microscopy, using Fluorescence in situ hybridization (FISH) with probes specific for the EPO gene region.