Quantitative proteomics using novel trifunctionalized metal coded affintiy tags

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Im Projekt wird ein Konzept vorgestellt, dass eine differenzielle quantitative und qualitative Proteomcharakterisierung mit Hilfe von neuartigen metallcodierten Markern und massenspektrometrischen Methoden (ESI-MS/MS) sowie neuen Entwicklungen in der Bioinformatik beinhaltet. Der Metallcode ist ein makrocyclischer Metallchelatkomplex, der mit einer aminosäurespezifischen funktionellen Gruppe und einer weiteren Molekülkomponente zur chromatographischen Trennung der markierten Peptide ausgestattet ist. Es muss sich durch gute Wasserlöslichkeit und hohe kinetische Stabilität über einen möglichst großen pH-Bereich auszeichnen. Verbindungen mit verschiedenen Metallionen dürfen sich hinsichtlich ihrer chemischen Reaktivität und physikalischen Eigenschaften nicht signifikant unterscheiden. Die metallcodierten Marker werden site-spezifisch kovalent an die Proteine von Zelllysaten gebunden. Im Anschluss an die Proteolyse der Proteine werden die metallmarkierten Peptide isoliert und chromatographisch weiter aufgetrennt, um dann massenspektrometrisch quantifiziert und im zweiten Schritt sequenziert zu werden. In Verbindung mit einer Datenbanksuche ist es möglich, anhand nur weniger Peptide die gesuchten Stammproteine zu identifizieren. Die metallcodierten Marker werden hinsichtlich ihrer Struktur, ihrer thermodynamischen Eigenschaften in wässriger Lösung, ihres Reaktionsverhaltens gegenüber Proteinen/Peptiden und ihrer Detektierbarkeit mit massenspektrometrischen Methoden charakterisiert. Ihre reproduzierbare Anwendbarkeit in der Proteomanalyse muss an Modellversuchen und Realproben in Verbindung mit mehrdimensionaler Chromatographie, MS/MS und Datenbankanalyse getestet werden.