ツ-ハイブリッド系によるArnt及びPASタンパク質に結合する因子の単離

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ArntのC端末部に存在する転写活性化ドメインを除いた部分を、GAL4のDNA結合部位のC末端につなぎ、いわゆる、酵母のツ-ハイブリッドシステムを用いて、Arnt結合タンパク質をヒト胎児肝臓のcDNAライブラリーと、マウスリンフォーマのcDNAライグラリー、それぞれ約百万個ずつスクリーニングした。その結果ヒト胎児肝臓ライブラリーから4種の、マウスリンフォーマライブラリーから11種のクローンを得た。この中で既知のクローンは5種であった。HLHとPASドメインをもつクローンはなかった。Arntとの相互作用が比較的強い、有望と思われるものを選びさらに検討した。N末端部分がかけていたので、マウス脾臓cDNAライブラリーをスクリーニングし、full lengthのcDNAを得た。このcDNAクローンは534残基のアミノ酸からなるタンパク質をコードしていた。塩基性アミノ酸と酸性アミノ酸に富み、全体としてはプラスにチャージしていた。酵母で発現させその活性を調べたところ、AhリセプターとArntとの複合体の転写活性を、数倍強めることが分かった。またHIF-1aとArntとの複合体の転写活性も増強した。これらの結果は、見いだされたタンパク質が、Arnt依存性の転写を活性化するコアティベータ-であることを強く示唆する。ほ乳類培養細胞では、内在性の発現があるせいか現在までのところ、酵母で見られた活性は観察されていない。ノーザンブロッティングの結果、本遺伝子は全ての組織で発現していた。また細胞内局在を調べた結果、核に存在していることが分かった。