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精製した転写因子を用いたP4501A1遺伝子の誘導的発現のインビトロ解析

使用纯化的转录因子体外分析 P4501A1 基因的诱导表达

基本信息

批准号：
06680601
负责人：
十川和博
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1994
资助国家：
日本
起止时间：
1994 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-06680601/
关键词：
Ahリセプター Arnt Sp1 バキュロウイルス発現系 RNAポリメラーゼ

项目摘要

P4501A1遺伝子の転写に必要な三つの転写因子Ahリセプター、Arnt、Splをバキュロウイルスの発現系を使って調製した。得られた粗抽出物をさらにニッケルアルフィニティークロマトグラフィーでさらに精製した。この操作で5x10^8の細胞から20μgのAhリセプター、80μgのArnt、80μgのSp1をそれぞれ純度20%,80%,80%で得ることができた。またSp1についてはHeLa細胞核抽出液からも分離精製した。これらの因子とその特異性抗体を使ってSp1とAhリセプター、Sp1とArntが結合することを見いだした。さらに、これらの精製因子と、AhリセプターとArntのヘテロダイマーが認識するXREを4個、Sp1が認識するGCボックスを1個プロモーターにもつGフリーカセットをテンプレートに使ってインビトロ転写実験を行った。基本転写因子群はRNAポリメラーゼを含むHeLa細胞の核抽出液で、すでにわかっているSp1の転写効果をまず検討したところ、バキュロウイルス発現系で調製したSp1よりもHeLa細胞由来のSp1の方が転写活性が強かった。バキュロウイルス発現系のSp1はコンフォメーションが十分でない可能性がある。つぎにAhリセプター、Arntの添加効果を調べたところSp1のみに比較して約2倍の転写活性化を観察した。Ahリセプター、Arntだけでは転写活性化はおきなかった。これらの結果は動物実験や培養細胞でのP4501A1遺伝子のAhリセプターとArntを介した転写活性化(約30倍)には及ばないものの3個の転写因子の寄与を確認したことになり、一定の成果を得ることができた。

It is necessary for P4501A1 to write three factors, Ah, Arnt, Spl, to make sure that it is necessary to do so. The crude extract has to be picked up in the form of a crude extract. The operation is 5x10 ^ 8 cell, 20 μ g Ah temperature, 80 μ g Arnt, 80 μ g SP1 temperature, 20% temperature, 80% temperature. The nuclear extract of Sp1 was isolated from semen by HeLa. The specific antibodies were used to combine the specific antibodies of Sp1, Sp1 and Arnt with the specific antibodies. You need to know that there are four XRE and one Sp1 GC that you need to know, that is, the precision factor, Ah, Sp1, GC, and so on. You need to make sure that you can write a real line. The basic factor group "RNA" contains HeLa cells "nuclear extract", "Sp1"write", "Sp1"HeLa", "Sp1" is the origin of the Sp1 cell. I don't know what to do. I don't know. I don't know if it's possible. Add the following information: "Ah", "Arnt", "write activity", "Sp1", "write activation". Ah, Arnt, write, write. The result of this experiment is that the three writing factors (about 30 times) of P4501A1, Ah, and Arnt are sent to you to confirm that the results will be successful.