精製した転写因子を用いたP4501A1遺伝子の誘導的発現のインビトロ解析

使用纯化的转录因子体外分析 P4501A1 基因的诱导表达

• 批准号: 06680601
• 负责人: 十川 和博
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Tohoku University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-06680601/
• 关键词: Ahリセプター; Arnt; Sp1; バキュロウイルス発現系; RNAポリメラーゼ

P4501A1遺伝子の転写に必要な三つの転写因子Ahリセプター、Arnt、Splをバキュロウイルスの発現系を使って調製した。得られた粗抽出物をさらにニッケルアルフィニティークロマトグラフィーでさらに精製した。この操作で5x10^8の細胞から20μgのAhリセプター、80μgのArnt、80μgのSp1をそれぞれ純度20%,80%,80%で得ることができた。またSp1についてはHeLa細胞核抽出液からも分離精製した。これらの因子とその特異性抗体を使ってSp1とAhリセプター、Sp1とArntが結合することを見いだした。さらに、これらの精製因子と、AhリセプターとArntのヘテロダイマーが認識するXREを4個、Sp1が認識するGCボックスを1個プロモーターにもつGフリーカセットをテンプレートに使ってインビトロ転写実験を行った。基本転写因子群はRNAポリメラーゼを含むHeLa細胞の核抽出液で、すでにわかっているSp1の転写効果をまず検討したところ、バキュロウイルス発現系で調製したSp1よりもHeLa細胞由来のSp1の方が転写活性が強かった。バキュロウイルス発現系のSp1はコンフォメーションが十分でない可能性がある。つぎにAhリセプター、Arntの添加効果を調べたところSp1のみに比較して約2倍の転写活性化を観察した。Ahリセプター、Arntだけでは転写活性化はおきなかった。これらの結果は動物実験や培養細胞でのP4501A1遺伝子のAhリセプターとArntを介した転写活性化(約30倍)には及ばないものの3個の転写因子の寄与を確認したことになり、一定の成果を得ることができた。

P4501A1 posthumous son 伝 の planning write に な three necessary つ の is planning to write factor Ah リ セ プ タ ー, Arnt, Spl を バ キ ュ ロ ウ イ ル ス の 発 now is を make っ て modulation し た. To obtain the られた crude extract をさらにニッケ をさらにニッケ ア ア フィニティ フィニティ ロ ロ トグラフィ トグラフィ でさらに でさらに refined た た. こ の operating で 5 x10 8 の ^ cells か ら 20 mu g の Ah リ セ プ タ ー, 80 mu g の Arnt, 80 mu g の Sp1 を そ れ ぞ れ purity 20%, 80%, 80% で る こ と が で き た. Youdaoplaceholder0 Sp1に ら て て て nuclear extract of HeLa また ら ら separation and refinement <s:1> た. こ れ ら の factor と そ の specificity antibody を っ て Sp1 と Ah リ セ プ タ ー, Sp1 と Arnt が combining す る こ と を see い だ し た. さ ら に, こ れ ら の refined factor と, Ah リ セ プ タ ー と Arnt の ヘ テ ロ ダ イ マ ー が know す る XRE を 4, Sp1 が know す る GC ボ ッ ク ス を 1 プ ロ モ ー タ ー に も つ G フ リ ー カ セ ッ ト を テ ン プ レ ー ト に make っ て イ ン ビ ト ロ planning write be 験 を line っ た. Basic planning factor group of は RNA ポ リ メ ラ ー ゼ を containing む HeLa の nuclear extract で, す で に わ か っ て い る Sp1 の planning write unseen fruit を ま ず beg し 検 た と こ ろ, バ キ ュ ロ ウ イ ル ス 発 now is で modulation し た Sp1 よ り も HeLa origin の Sp1 の party が strong planning write activity が か っ た. The バキュロウ バキュロウ ス ス ス occurrence is that there is a very high possibility がある of <s:1> Sp1 コ コ フォメ フォメ ショ ショ が が. つ ぎ に Ah リ セ プ タ ー, Arnt の add working fruit を adjustable べ た と こ ろ Sp1 の み に compare し て about 2 times の planning write activeness を 観 examine し た. Ahリセプタ リセプタ, Arntだけで だけで 転 転 write activation お お な な った った. こ れ ら の results は animals be 験 や culture cell で の P4501A1 posthumous son 伝 の Ah リ セ プ タ ー と Arnt を interface し た planning write activeness (about 30 times) に は and ば な い も の の three の planning write factor の send confirm with を し た こ と に な り, certain の results を る こ と が で き た.

项目成果

K.Sogawa: "Possible Function of Ah Receptor Naclear Translodtor(Arnt)homaodimer in Transciptional Regulation" Proe.Natl.Acad.Sci.U.S.A. (in press).

K.Sokawa：“Ah 受体 Naclear Translodtor(Arnt)homaodimer 在转录调节中的可能功能”Proe.Natl.Acad.Sci.U.S.A.

J.Mimura: "A Complete Structure of the Ah Receptor Gene" Pharmacogenetics. 4. 349-354 (1994)

J.Mimura：“Ah 受体基因的完整结构”药物遗传学。

M.Ema: "Human Arylhydroearbon Receptor:Functional Expression and Chromosmal Assignment to 7 p21" J.Biochem.116. 845-851 (1994)

M.Ema：“人芳基氢碳受体：功能表达和 7 p21 的染色体分配”J.Biochem.116。

M.Ema: "Dioxin Binding Activities of Polymorphic Forms of Mouse and Human Arylhydrocarbon Receptors" J.Biol.Chem.269. 27337-27343 (1994)

M.Ema：“小鼠和人芳基烃受体多晶型物的二恶英结合活性”J.Biol.Chem.269。

A.Kobayashi: "Analysis of Functional Domains of a GC Box-Birding Protein,BTEB" J.Biochem.117. 91-95 (1995)

A.Kobayashi：“GC Box-Birding 蛋白 (BTEB) 功能域的分析”J.Biochem.117。