非特異的結合のない超高感度ウィルス検出に向けたデジタル免疫測定法

本研究では、独自に開発した１分子デジタル酵素結合免疫吸着（デジタルELISA）法を改良して、標識抗体の非特異的結合の影響を受けない超高感度デジタルELISA法の確立を目指している。デジタルELISA法では、確率的に１分子の捕捉抗体―抗原－酵素標識抗体のELISA複合体をマイクロビーズ上に固定化し、これを１個ずつ体積フェムトリットルサイズの超微小溶液チャンバーに封入する。ビーズがELISA複合体を結合する場合、酵素が産生する蛍光性反応生成物がチャンバー中に蓄積するため、光るチャンバー数を数え上げるだけで抗原分子数を1分子単位で検出することができる。これまで、通常法と比較して100万倍という超高感度化に成功しており、ウィルス等の感染因子の超高感度検出への応用が強く期待されている。しかし、現在用いられている標識用の酵素であるβ-ガラクトシダーゼ(β-gal)は、反応速度が毎秒10回程度と遅く、定量的な蛍光強度計測が極めて難しい。そこで、本プロジェクトでは、まずβ-galを、蛍光アッセイ用の人工基質(FDG)に最適化するための進化分子工学実験に取り組んでいる。これまでに、野生型β-gal遺伝子をクローニングし、その配列確認を行った。その後、β-galの精製法を確立した後酵素速度論的な評価を行った結果、文献値とほぼ一致することを確認した。また、精製β-galの安定な保存条件も探索し、再現性の良い酵素評価系の確立に成功した。更に、酵素のスクリーニング実験に向けて、マイクロチャンバーアレイデバイスで１分子からの無細胞タンパク質合成を実現した。スクリーニングの際、遺伝子型と表現型を対応づけるため、１分子DNAを回収・増幅する技術を確立した。それにより、優れたタンパク質変異体を遺伝子レベルで簡単に調べられるようにした。

本研究では、独自に開発した１分子デジタル酵素結合免疫吸着（デジタルELISA）法を改良して、標識抗体の非特異的結合の影響を受けない超高感度デジタルELISA法の確立を目指している。デジタルELISA法では、確率的に１分子の捕捉抗体―抗原－酵素標識抗体のELISA複合体をマイクロビーズ上に固定化し、これを１個ずつ体積フェムトリットルサイズの超微小溶液チャンバーに封入する。ビーズがELISA複合体を結合する場合、酵素が産生する蛍光性反応生成物がチャンバー中に蓄積するため、光るチャンバー数を数え上げるだけで抗原分子数を1分子単位で検出することができる。これまで、通常法と比較して100万倍という超高感度化に成功しており、ウィルス等の感染因子の超高感度検出への応用が強く期待されている。しかし、現在用いられている標識用の酵素であるβ-ガラクトシダーゼ(β-gal)は、反応速度が毎秒10回程度と遅く、定量的な蛍光強度計測が極めて難しい。そこで、本プロジェクトでは、まずβ-galを、蛍光アッセイ用の人工基質(FDG)に最適化するための進化分子工学実験に取り組んでいる。これまでに、野生型β-gal遺伝子をクローニングし、その配列確認を行った。その後、β-galの精製法を確立した後酵素速度論的な評価を行った結果、文献値とほぼ一致することを確認した。また、精製β-galの安定な保存条件も探索し、再現性の良い酵素評価系の確立に成功した。更に、酵素のスクリーニング実験に向けて、マイクロチャンバーアレイデバイスで１分子からの無細胞タンパク質合成を実現した。スクリーニングの際、遺伝子型と表現型を対応づけるため、１分子DNAを回収・増幅する技術を確立した。それにより、優れたタンパク質変異体を遺伝子レベルで簡単に調べられるようにした。