非特異的結合のない超高感度ウィルス検出に向けたデジタル免疫測定法

用于超灵敏病毒检测的数字免疫分析，无需非特异性结合

• 批准号: 13F03378
• 负责人: 野地 博行
• 金额: $ 1.47万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2013
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2013-04-01 至 2016-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13F03378/
• 关键词: 酵素; 遺伝子クローニング; 無細胞タンパク質合成; マイクロデバイス; 活性測定; スクリーニング; 一分子; タンパク質発現; タンパク質精製

本研究では、独自に開発した１分子デジタル酵素結合免疫吸着（デジタルELISA）法を改良して、標識抗体の非特異的結合の影響を受けない超高感度デジタルELISA法の確立を目指している。デジタルELISA法では、確率的に１分子の捕捉抗体―抗原－酵素標識抗体のELISA複合体をマイクロビーズ上に固定化し、これを１個ずつ体積フェムトリットルサイズの超微小溶液チャンバーに封入する。ビーズがELISA複合体を結合する場合、酵素が産生する蛍光性反応生成物がチャンバー中に蓄積するため、光るチャンバー数を数え上げるだけで抗原分子数を1分子単位で検出することができる。これまで、通常法と比較して100万倍という超高感度化に成功しており、ウィルス等の感染因子の超高感度検出への応用が強く期待されている。しかし、現在用いられている標識用の酵素であるβ-ガラクトシダーゼ(β-gal)は、反応速度が毎秒10回程度と遅く、定量的な蛍光強度計測が極めて難しい。そこで、本プロジェクトでは、まずβ-galを、蛍光アッセイ用の人工基質(FDG)に最適化するための進化分子工学実験に取り組んでいる。これまでに、野生型β-gal遺伝子をクローニングし、その配列確認を行った。その後、β-galの精製法を確立した後酵素速度論的な評価を行った結果、文献値とほぼ一致することを確認した。また、精製β-galの安定な保存条件も探索し、再現性の良い酵素評価系の確立に成功した。更に、酵素のスクリーニング実験に向けて、マイクロチャンバーアレイデバイスで１分子からの無細胞タンパク質合成を実現した。スクリーニングの際、遺伝子型と表現型を対応づけるため、１分子DNAを回収・増幅する技術を確立した。それにより、優れたタンパク質変異体を遺伝子レベルで簡単に調べられるようにした。

This study provides an independent guide to the development of a molecular enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) that is influenced by the nonspecific binding of marker antibodies. The ELISA complex of capture antibody-antigen-enzyme-labeled antibody was immobilized on the surface of the ELISA with high accuracy, and the ultra-micro solution of the capture antibody-antigen-enzyme-labeled antibody was encapsulated in a single volume. In the case of ELISA complex binding, the enzyme is produced, the fluorescent reaction product is accumulated, the number of fluorescent reaction products is increased, and the number of antigen molecules is increased. This method is more than 100 million times more effective than the normal method. It is expected that the infection factors such as high sensitivity will be successfully detected. It is extremely difficult to measure the light intensity of the enzyme used for identification, such as β-gal (β-gal), and the speed of reaction, which is 10 cycles per second. The evolutionary molecular engineering approach to optimization of artificial substrates (FDG) for optical applications is described in detail below. The wild-type β-gal gene was identified by sequence analysis. After the establishment of the β-gal purification method, the evaluation results of the enzyme rate theory were confirmed. The stability of β-gal and its reproducibility were investigated and the enzyme evaluation system was established successfully. In addition, the enzyme's activity is controlled by the enzyme's activity, and the enzyme's activity is controlled by the enzyme's activity. The technology of DNA amplification was established. All right, all right.

项目成果

Directed evolution of enzymes using femtoliter chamber array system

使用飞升室阵列系统进行酶的定向进化

• 发表时间: 2015
• 作者: Yi Zhang;Hiroto Kizoe;Kazuhito V. Tabata;Hiroyuki Noji
• 通讯作者: Hiroyuki Noji

Development of enzyme screening system for directed evolution based on enzymic activity

基于酶活性的定向进化酶筛选系统的开发

• 发表时间: 2014
• 作者: Yi Zhang;Hiroto Kizoe;Ryota Iino;Kazuhito Tabata;Hiroyuki Noji
• 通讯作者: Hiroyuki Noji