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In vivo genome editing using hepatocyte-targeted RNA delivery system

使用肝细胞靶向 RNA 递送系统进行体内基因组编辑

基本信息

批准号：
19F19116
负责人：
片岡一則
金额：
$ 1.47万
依托单位：
Kawasaki Institute of Industrial Promotion Innovation Center of NanoMedicine
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2019
资助国家：
日本
起止时间：
2019-04-25 至 2021-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19F19116/
关键词：
RNA医薬ゲノム編集高分子ミセル CRISPR/Cas9

项目摘要

本研究では、Cas9 mRNAとガイドRNAを用いたCRISPR/Cas9生体内導入による肝臓でのゲノム編集を目指し、RNA送達のための高分子ミセル開発に取り組んだ。その際、(1)生体内でのRNA酵素分解の抑制、(2)鎖長の大きく異なるCas9 mRNAとガイドRNAの共送達法の確立、(3)肝細胞指向性の付与が課題となった。前年度、(1)を達成し、(2)についてin vitroで基礎的な知見を得ていたため、本年度は(2)のin vivo試験と(3)に取り組んだ。(2)について、Cas9 mRNAとガイドRNAを共搭載したミセルを開発したところ、それぞれを単独で搭載したミセルを混合して投与した場合と比べ、優れた生体内ゲノム編集活性を示めした。物理化学的メカニズム解析の結果、共搭載により短鎖RNAがより安定にミセル内に保持されることが明らかとなった。(3)について、肝細胞表面のアシアロ糖タンパク質受容体のリガンドであるトリアンテナNアセチルガラクトサミンをミセル表面に搭載することで、静脈内投与後のミセルの肝集積性が10倍以上向上した。in vivo共焦点顕微鏡を用いた生きたマウスの肝臓のリアルタイム観察により、ミセルの類洞内皮細胞トランスサイトーシスによる能動的な肝実質への移行が示唆された。さらに、このリガンドを表面に修飾し、Cas9 mRNAとガイドRNAを共搭載したミセルをマウスに投与したところ、肝実質細胞において、効率的なゲノム編集が観察された。このように当初の計画内容を実現した。また、当初の計画を超えて、脳へのゲノム編集にも取り組んだ。Cas9 mRNAとガイドRNAを共搭載したミセルを用いることで、神経細胞、アストロサイト、ミクログリアにゲノム編集活性を得ることができた。RNAを用いて脳実質でのゲノム編集を実現した世界で初めての報告である。

In this study, we investigated the molecular structure of CRISPR/Cas9 mRNA and RNA in vivo. This paper discusses the following issues: (1) inhibition of RNA enzyme decomposition in vivo,(2) establishment of a co-delivery method for Cas9 mRNA and RNA in the gene chain,(3) targeting of hepatocytes. Previous year,(1) in vitro,(2) in vivo,(3) in vitro,(4) in vivo (2)The expression of Cas9 mRNA and Cas9 RNA was detected in a mixture of different tissues. Physico-chemical analysis of the results, a total of two short lock RNA, two stable, three internal, two open. (3)In addition, the liver accumulation after intravenous administration was more than 10 times higher than that after intravenous administration. In vivo confocal microscopy is used to detect the migration of active liver tissue in the presence of cavity-like endothelial cells. In addition, Cas9 mRNA and Cas9 RNA were co-loaded into the surface of the cell, and the expression of Cas9 mRNA and Cas9 mRNA was detected in the liver. The original plan was implemented. The original plan is to create a new set of files. Cas9 mRNA is co-loaded with the gene, and the gene is used in the brain cells. RNA is used in the preparation of the world's first report.