In vivo genome editing using hepatocyte-targeted RNA delivery system

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本研究では、Cas9 mRNAとガイドRNAを用いたCRISPR/Cas9生体内導入による肝臓でのゲノム編集を目指し、RNA送達のための高分子ミセル開発に取り組んだ。その際、(1)生体内でのRNA酵素分解の抑制、(2)鎖長の大きく異なるCas9 mRNAとガイドRNAの共送達法の確立、(3)肝細胞指向性の付与が課題となった。前年度、(1)を達成し、(2)についてin vitroで基礎的な知見を得ていたため、本年度は(2)のin vivo試験と(3)に取り組んだ。(2)について、Cas9 mRNAとガイドRNAを共搭載したミセルを開発したところ、それぞれを単独で搭載したミセルを混合して投与した場合と比べ、優れた生体内ゲノム編集活性を示めした。物理化学的メカニズム解析の結果、共搭載により短鎖RNAがより安定にミセル内に保持されることが明らかとなった。(3)について、肝細胞表面のアシアロ糖タンパク質受容体のリガンドであるトリアンテナNアセチルガラクトサミンをミセル表面に搭載することで、静脈内投与後のミセルの肝集積性が10倍以上向上した。in vivo共焦点顕微鏡を用いた生きたマウスの肝臓のリアルタイム観察により、ミセルの類洞内皮細胞トランスサイトーシスによる能動的な肝実質への移行が示唆された。さらに、このリガンドを表面に修飾し、Cas9 mRNAとガイドRNAを共搭載したミセルをマウスに投与したところ、肝実質細胞において、効率的なゲノム編集が観察された。このように当初の計画内容を実現した。また、当初の計画を超えて、脳へのゲノム編集にも取り組んだ。Cas9 mRNAとガイドRNAを共搭載したミセルを用いることで、神経細胞、アストロサイト、ミクログリアにゲノム編集活性を得ることができた。RNAを用いて脳実質でのゲノム編集を実現した世界で初めての報告である。