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人為的ゲノム改変によるネオセントロメア創生の試み

尝试通过人工基因组修饰创建新着丝粒

基本信息

批准号：
15657048
负责人：
高橋考太
金额：
$ 2.11万
依托单位：
Kurume University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2004
项目状态：
已结题

项目摘要

これまでは偶発的な出現しか報告されていなかったネオセントロメア獲得細胞株を、実験操作による人為的誘導によって取得しその包括的解析を可能にするために本研究で当初目標とした、染色体セントロメア領域の特異的な破壊を条件的に誘導する分裂酵母モデル系の構築を達成した。まず、ORF中に部位特異的組み換え酵素の標的配列が挿入されながらもG418薬剤耐性を付与する分裂酵母マーカー遺伝子の作成に成功し、その発現条件の検討を十分に行なった。その上で、第一染色体セントロメア領域の両端にその改変マーカー遺伝子を組み換え酵素標的配列部分が重複するように2つに分断して挿入した。さらに両挿入部位のセントロメア内側にはura4^+遺伝子も挿入した。この細胞に組み換え酵素を発現させるとセントロメア領域の染色体からの切除が発生し、分断マーカー遺伝子の再縫合によってG418耐性が付与される。セントロメア欠失は基本的に細胞致死となるが、そこからの低頻度な復帰生存株の出現は大スケール細胞からの厳密なG418選択によって感知可能となる。さらにura4^+遺伝子産物によって毒性化される5-FOA薬剤を培地に添加することで、セントロメア由来環状DNAの第一染色体への再挿入による生存株の排除が行なえるように設定した。この分裂酵母アッセイ株を用いてネオセントロメア獲得株のスクリーンを行ない、有意義な好結果が産出されている。2x10^<10>細胞に対してセントロメア破壊を誘導しG418選択をかけた結果、サイズの異なる約10000コロニーのG418耐性株が得られた。ここでのセントロメア破壊の復帰頻度は5x10^<-7>と算出されるが、スクリーン条件を考慮すると過大評価の可能性もある。現在個々の復帰細胞の解析を進めており、まずはネオセントロメアの獲得について確認している。また、それらの染色体レベルでの変化を低頻度制限酵素処理とPFG電気泳動解析などで解析している。

The aim of this study was to construct a yeast cell line based on a domain-specific induction condition for the production of cell lines and artificial induction during manipulation, including analysis, which was possible. A site-specific sequence of enzymes in the ORF was successfully constructed and the conditions for their development were discussed. The first chromosome is divided into two parts: the second chromosome is divided into two parts: the first chromosome is divided into two parts: the first chromosome is divided into two parts: the second chromosome is divided into two parts: the first chromosome is divided into two parts: the first chromosome is divided into two parts: the second chromosome is divided into two parts: the first chromosome is divided into two parts: the second chromosome is divided into two parts: the first chromosome is divided into two parts: the second chromosome is divided into two parts: the third chromosome is divided into two parts: the fourth chromosome is divided into two parts: the third chromosome is divided into two parts: the third chromosome is divided into two parts: the fourth chromosome is divided into two parts: the third chromosome is divided into three parts: the fourth chromosome is divided into two parts. This is the first time I've ever seen a woman who's been in a relationship with someone else. This cell is composed of enzymes for gene transformation, and G418 tolerance is assigned to chromosome excision in the field of gene transformation, gene recombination, and gene recombination. The presence of a low frequency of re-entry survival strains due to the absence of basic cell death is likely to be detected by G418 selection. The 5-FOA gene was added to the culture medium of the ura4^+ gene product, and the survival strain was excluded from the reinsertion of the first chromosome of the circular DNA. This split yeast strain can be used to produce meaningful and good results. 2x10^<10>cells were selected for induction of G418 resistant strains. The results showed that G418 resistant strains were induced for induction of G418 resistant strains. The frequency of re-entry of this error is calculated as 5x10^<-7>, and the condition of re-entry is considered. Now the analysis of a complex cell is in progress, and the results are confirmed. Low frequency restriction enzyme processing and PFG electrokinetic analysis

项目成果

期刊论文数量（3）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

Mis16 and Mis18 are required for CENP-A loading and histone deacetylation at centromeres

DOI：
10.1016/j.cell.2004.09.002
发表时间：
2004-09-17
期刊：
CELL
影响因子：
64.5
作者：
Hayashi, T;Fujita, Y;Yanagida, M
通讯作者：
Yanagida, M

Chromosome cohesion and segregation. in "The molecular biology in fission yeast"

染色体凝聚和分离。

DOI：
发表时间：
2003
期刊：
影响因子：
0
作者：
Sarma K;Nishioka K;Reinberg D;Kohta Takahashi;Aki Minoda;Tatsuro Yuasa;Takeshi Hayashi;Kohta Takahashi
通讯作者：
Kohta Takahashi

An interactive gene network for securin-separase, condensin, cohesin, Dis1/Mtc1 and histones constructed by transformation.

通过转化构建了 securin-separase、condensin、cohesin、Dis1/Mtc1 和组蛋白的交互式基因网络。