权益分类	功能权益	普通用户	{{item.name}}会员
{{category.name}}	{{benefitItem.name}}

遺伝生化学的手法による転写因子NF-κBの活性制御因子の網羅的スクリーニング

利用遗传生化方法全面筛选转录因子NF-κB活性调节因子

基本信息

批准号：
17657046
负责人：
牟田達史
金额：
$ 2.24万
依托单位：
Tohoku University (2006)Kyushu University (2005)
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2006
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では、NF-κB活性化因子の網羅的スクリーニングを目的として、まず、NF-κB応答性のE-selectin遺伝子のプロモーターの制御下に、それぞれネオマイシン耐性遺伝子、Green fluorescence protein(GFP)遺伝子、CD14遺伝子を発現するレポータープラスミド3種を構築した。構築したプラスミドを、ブラストサイジン抵抗性遺伝子とともに、interleukin(IL)-3依存性の浮遊細胞であるBa/F3に導入し、ブラストサイジン存在下で数週間培養することにより、stable transformantを十数種類樹立した。また、NF-κB活性化を惹起するレトロウイルスの陽性コントロールとして、Toll-like receptor及びIL-1 receptorの下流で機能するアダプター分子MyD88のN末端側、さらに陰性コントロールとして同分子のC末端側のcDNAを、pMY-IRES-GFPレトロウイルスベクターに導入した。本年度は、これらのレトロウイルスベクターをPlatE細胞に遺伝子導入後、それぞれの遺伝子を発現するレトロウイルスを含む培養上清を回収した。これらの培養上清をそれぞれ、先に樹立したネオマイシン耐性のレポーター遺伝子を導入したBa/F3細胞由来stable transformantに感染させ、ネオマイシン存在下で培養し、レポーター遺伝子発現株の選択を試みた。その結果、一つの株で、MyD88のN末端側を発現するレトロウイルス感染時に特異的な生存が観察された。従って本法は、NF-κB活性化因子の網羅的スクリーニング法として有効であることが示唆された。今後の課題として、スクリーニング効率の上昇を目指した、レポーター遺伝子自身や、スクリーニングに用いる細胞株の更なる改良が望まれる。

In this study, we constructed three types of regulatory mechanisms for NF-κB activation factor expression, including the expression of NF-κB responsive E-selectin gene, the expression of NF-κB resistant gene, Green fluorescence protein(GFP) gene, and CD14 gene. A number of species of resistant and stable transformants were established by introducing Ba/F3 into the culture medium in the presence of IL-3-dependent planktonic cells. The downstream function of Toll-like receptor and IL-1 receptor was induced by activation of NF-κB, and the N-terminal cDNA of MyD88 and the C-terminal cDNA of pMY-IRES-GFP were introduced. This year, the culture supernatant was recovered after the introduction of the gene into PlatE cells and the development of the gene. The culture supernatant was cultured in the presence of stable transformant, and the selection of resistant strains was tested. As a result, the presence of MyD88 on the N-terminal side of a single strain was observed during infection. This method is based on the analysis of NF-κB activation factors. Future problems include the improvement of cell strain efficiency, cell culture efficiency and cell culture efficiency.