自然免疫系の活性化におけるシャペロンの機能

伴侣在激活先天免疫系统中的功能

• 批准号: 14037252
• 负责人: 牟田 達史
• 金额: $ 1.86万
• 依托单位: Kyushu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-14037252/
• 关键词: 自然免疫; マクロファージ; toll-like receptor (TLR); シャペロン; NF-κB; 熱ショックタンパク質; 発現系; 炎症

自然免疫系を活性化することが近年報告されたシャペロンタンパク質の一種である熱ショックタンパク質(Hsp)60について、その構造機能相関を明らかにすることを目的に、以下の実験を行った。まず、Hsp60の野生型に加え、ATP結合部位、基質結合部位にそれぞれ変異をもつD111K、L283S変異体を作成し、大腸菌を用いた発現系を構築した。アミノ末端側に人為的に付加したHis-tagを用いて精製し、マクロファージの刺激活性についてNF-κB活性を指標に測定したところ、いずれの変異体を用いた場合にも刺激活性が検出された。大腸菌由来の何らかの自然免疫系活性化物質の微量混入の可能性が考えられたため、さらにイオン交換クロマトグラフィーによる精製を試みたが、同様に変異体においても活性が検出された。次に細菌由来の物質の混入の可能性を防ぐため、バキュロウイルスと昆虫細胞を用いた発現系を構築した。大腸菌の発現系の場合と同じく、付加したHis-tagによって精製した標品の活性を測定したところ、この系では、野生型Hsp60にもマクロファージ刺激活性は検出できなかった。これらの結果は、これまで報告されている組換えHsp60のもつ自然免疫系刺激活性は、発現に用いた大腸菌由来の物質に依存していた可能性を示唆している。一方、His-tagを含むHsp60はそのシャペロン活性発現に重要な14量体形成ができないといわれていることから、最近、tagを除去したネイティブなHsp60の昆虫細胞発現系を構築した。現在までに、細胞の粗抽出液を用いてマクロファージ刺激活性を測定したが、活性は検出されなかった。今後、さらにこの昆虫細胞で発現したHsp60を精製し、ATPase活性を確認しつつ、自然免疫系刺激活性について検討したい。また、同じく昆虫細胞発現系を構築したHsp70、90を用いて、細胞刺激活性について検討したい。

Natural immune system を activeness す る こ と が recent report さ れ た シ ャ ペ ロ ン タ ン パ ク qualitative の a で あ る hot シ ョ ッ ク タ ン パ ク mass (Hsp) 60 に つ い て, そ の function of tectonic facies masato を Ming ら か に す る こ と に を purpose, the following の be 験 を line っ た. ま ず, Hsp60 の wild-type に add え, ATP binding site and substrate binding site に そ れ ぞ れ - different を も つ D111K, L283S - variant を make し, coliform を with い た 発 now is を build し た. ア ミ ノ end side に artificial に plus し た ihs - tag を with い て refined し, マ ク ロ フ ァ ー ジ の stimulate active に つ い て nf-kappa B activity を indexes に し た と こ ろ, い ず れ の - variant を with い た occasions に も stimulate active が 検 out さ れ た. What coliform origin の ら か の trace mixed with natural immune system activation material の の possibility が exam え ら れ た た め, さ ら に イ オ ン exchange ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー に よ る refined を try み た が, with others in に - variant に お い て も active が 検 out さ れ た. Time に bacterial origin の の material mixed with の possibility を anti ぐ た め, バ キ ュ ロ ウ イ ル ス と insect cell を with い た 発 now is を build し た. Coliform の と 発 now is の occasions with じ く, plus し た ihs - tag に よ っ て refined し た standard product を の activity determination し た と こ ろ, こ の is で は, wild type Hsp60 に も マ ク ロ フ ァ ー ジ stimulate active は 検 out で き な か っ た. こ れ ら の results は, こ れ ま で report さ れ て い る group in え Hsp60 の も つ は natural immune system to stimulate activity, 発 now に い た coliform origin の material に dependent し て い を た possibility in stopping し て い る. One party, the ihs - tag contains を む Hsp60 は そ の シ ャ ペ ロ ン active 発 に な 14 important quantity body form now が で き な い と い わ れ て い る こ と か ら, recently, the tag を remove し た ネ イ テ ィ ブ な Hsp60 の insect cell 発 now を build し た. Now ま で に, cell の crude extract を with い て マ ク ロ フ ァ ー ジ を stimulate activity determination し た が, active は 検 out さ れ な か っ た. Insect cell lines in the future, さ ら に こ の で 発 now し た Hsp60 を refined し, ATPase activity を confirm し つ つ, natural immune system to stimulate activity に つ い て beg し 検 た い. ま た, with じ く insect cell 発 now を build し た Hsp70, 90 を い て, cells stimulate activity に つ い て beg し 検 た い.

项目成果

Kairies, N.et al.: "The 2.0 Å Crystal Structure of Tachylectin 5A Provides Evidence for the Common Origin of the Innate Immunity and the Blood Coagulation Systems"Proceedings of the Natonal Academy of Science of Science of the United States of America. 98

Kairies, N. 等人：“速凝素 5A 的 2.0 Å 晶体结构为先天免疫和血液凝固系统的共同起源提供了证据”美国国家科学院院刊 98。

Muta, T., et al.: "IκB-ζ, a New Anti-inflammatory Nuclear Protein Induced by Lipopolysaccharide, Is a Negative Regulator for Nuclear Factor-κB"Journal of Endotoxin Research. (in press).

Muta, T. 等人：“IκB-ζ，一种由脂多糖诱导的新型抗炎核蛋白，是核因子-κB 的负调节剂”内毒素研究杂志（正在出版）。

Muta, T., et al.: "Essential Roles of CD14 and Lipopolysaccharide-binding Protein for Activation of Toll-like receptor (TLR) 2 as Well as TLR4"European Journal of Biochemistry. 268・16. 4580-4589 (2001)

Muta, T., et al.：“CD14 和脂多糖结合蛋白对 Toll 样受体 (TLR) 2 以及 TLR4 激活的重要作用”欧洲生物化学杂志 268·16 (2001)。

Nakamuta M, et al.: "Bisphenol A Diglycidyl Ether (BADGE) Suppresses Tumor Necrosis Factor-αProduction as a PPARγAgonist in the Murine Macrophage-like Cell Line, RAW 264.7"Cell Biology International. 26・3. 235-241 (2002)

Nakamuta M 等人：“双酚 A 二缩水甘油醚 (BADGE) 作为 PPARγ 激动剂在小鼠巨噬细胞样细胞系中抑制肿瘤坏死因子-α 的产生，RAW 264.7”《国际细胞生物学》26·3。

Takaki, T., et al.: "Duplicated Binding Sites for (1→3)-β-D-Glucan in the Horseshoe Crab Coagulation Factor G"Journal of Biological Chemistry. 277・16. 14281-14287 (2002)

Takaki, T., et al.：“鲎凝固因子 G 中的 (1→3)-β-D-葡聚糖的重复结合位点”生物化学杂志 277・16 (2002)。