情報伝達分子はどのように細胞内カルシウム応答を誘起するか?

信号分子如何诱导细胞内钙反应？

• 批准号: 14658218
• 负责人: 佐甲 靖志
• 金额: $ 1.86万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-14658218/
• 关键词: 上皮成長因子; カルシウム応答; 画像解析; 1分子計測; 蛍光測定; マイクロチップ; マイクロマニピュレーション

我々は、細胞膜に数百分子の上皮成長因子(EGF)が結合すれば、すべての細胞でカルシウム応答が起こることを発見した。これは細胞表面に発現する受容体の数の1%以下である。さらに、この分子数の閾値は、細胞の大きさによらないことが分かった。このような入出力応答を可能にする分子機構を解明するために、EGF刺激を時間、空間、濃度制御して細胞に与える装置を開発した。装置を、1分子計測、細胞内カルシウム計測を同時におこなえる顕微鏡に組み込んだ。蛍光色素テトラメチルローダミンで1:1標識したEGFを細胞外に灌流し全反射蛍光顕微鏡で結合数を1分子計測した。画像解析アルゴリズムを自作し分子数を自動計測できるようにした。また、細胞内カルシウム濃度は蛍光指示薬(Fluo4)を用いて計測した。この方法で、細胞に与えるEGFを制御しながら、カルシウム応答を計測できるようになった。同時計測の結果から、決まったEGF結合数により誘起される平均カルシウム濃度上昇は、結合数に依存して大きくなるが、細胞ごとのばらつきが大きく、一方、カルシウム応答が始まるまでの時間は、EGF結合数によらず一定であった。これは、EGF結合により確率的にON/OFFする反応が比較的少数並列に起こっていることを示唆している。細胞あたり300分子のEGF結合で半数の細胞にカルシウム応答が起こった。EGFは受容体の2量体化を誘起してカルシウム応答経路を動かすと考えられている。EGFの結合パターンの解析から、カルシウム応答確率は多量体形成して結合した分子数との相関が高く、単量体として結合した分子数との相関は低いことが分かった。多量体として結合した分子だけがカルシウム応答経路を動かすと仮定すると、半数の細胞に応答を引き起こす分子数は細胞あたり200分子と見積もられた。

I 々 は, cell membrane に hundreds of molecular の epithelial growth factor (EGF) が combining す れ ば, す べ て の cells で カ ル シ ウ ム 応 answer since が こ る こ と を 発 see し た. The number of する acceptors <e:1> on the cell surface に is less than 1% である. Youdaoplaceholder2 れ に Youdaoplaceholder0, <s:1> threshold of <s:1> molecular number さによらな, <s:1> cell size さによらな さによらな さによらな とが とが とが score った った. こ の よ う な into output 応 may answer を に す る molecular institutions を interpret す る た め に, concentration of EGF stimulation を time, space, suppression し て に cell and え る device を open 発 し た. Device を, 1-molecule measurement, intracellular カ なえる顕 シウム measurement を simultaneously にお なえる顕 なえる顕 micromirror に group み込んだ. 蛍 photopigment テ ト ラ メ チ ル ロ ー ダ ミ ン で 1:1 logo し た EGF を extracellular に perfusion し total reflection 蛍 light 顕 micromirror で combining several を 1 molecular measuring し た. Portrait analysis ア ア ゴリズムを ゴリズムを self-made molecular number of the molecule を automatic measurement で るように るように た た. Youdaoplaceholder0, intracellular カ カ シウム シウム concentration カ 蛍 photoindicator drug (Fluo4)を measured by て て meter た. こ の way で, cell に and え る EGF を suppression し な が ら, カ ル シ ウ ム 応 answer を measuring で き る よ う に な っ た. Results at the same time measuring の か ら, definitely ま っ た EGF combined with several に よ り induced さ れ る average カ ル シ ウ ム concentration rises は, combined with several に dependent し て big き く な る が, cell ご と の ば ら つ き が big き く, one party, カ ル シ ウ ム 応 beginning a が ま る ま で の time は, EGF combined with several に よ ら ず certain で あ っ た. こ れ は, EGF combined に よ り probabilistic に of ON/OFF す る anti 応 が comparison of minority in に こ っ て い る こ と を in stopping し て い る. Cell あた で 300 molecules of <s:1> EGF bind to で half of the <s:1> cell にカ シウム応 シウム応 answer が to form った った. EGF <s:1> acceptor <s:1> 2 quantification を induces てカ シウム応 シウム応 response を movement すと すと examination えられて る る る. EGF の combining パ タ ー ン の parsing か ら, カ ル シ ウ ム 応 a probabilistic は quantity body to form more し て combining し た number of molecules と の phase masato が く, 単 quantity body と し て combining し た number of molecules と の phase masato は low い こ と が points か っ た. More quantity body と し て combining し た molecular だ け が カ ル シ ウ ム 応 a 経 road を moving か す と 仮 set す る と, half の cell に 応 answer を lead き up こ す number of molecules は cells あ た り 200 molecular と see product も ら れ た.

项目成果

上田昌宏, 佐甲靖志: "GPCR型走化性受容体の細胞内1分子可視化解析"「バイオイメージングでここまで理解る」楠見明弘、小林剛、吉村昭彦、徳永万喜洋編実験医学別冊. 99-103 (2002)

Masahiro Ueda、Yasushi Sakō：“GPCR 型趋化受体的细胞内单分子可视化分析”“通过生物成像理解这一点”Akihiro Kusumi、Tsuyoshi Kobayashi、Akihiko Yoshimura、Makihiro Tokunaga 编辑的实验医学特刊。

Sako, Y., et al.: "Single-molecule visualization of cell signaling processes of epidermal growth factor receptor."J.Pharmacol.Sci.. 93. 253-258 (2003)

Sako, Y. 等人：“表皮生长因子受体的细胞信号传导过程的单分子可视化。”J.Pharmacol.Sci.. 93. 253-258 (2003)

Sako, Y., Uyemura, T.: "Total internal reflection fluorescence microscopy for single-molecule imaging in living cells"Cell Struct. Funct.. 27. 357-365 (2002)

Sako，Y.，Uyemura，T.：“用于活细胞单分子成像的全内反射荧光显微镜”细胞结构。

佐甲靖志: "一分子イメージング"医学のあゆみ. 200. 1092 (2002)

Yasushi Sakō：“单分子成像”医学史 200. 1092 (2002)。

Sako, Y.: "Imaging of biological molecules. 2. Membrane receptors""Nano-Optics" Kawata, S., Ohtsu, M., and Irie, M. ed.. 209-215 (2002)

Sako, Y.：“生物分子成像。2. 膜受体”“纳米光学”Kawata, S.、Ohtsu, M. 和 Irie, M. 编辑。209-215 (2002)