金属プロテアーゼの構造と触媒機構の解析

金属蛋白酶的结构及催化机制分析

• 批准号: 04225226
• 负责人: 岩永 貞昭
• 金额: $ 0.96万
• 依托单位: Kyushu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1992
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1992 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-04225226/
• 关键词: 金属プロテアーゼ; 合成ペプチド基質; クサリ蛇毒; 出血因子; 血栓性因子; サーモライシン; 一次構造; エンドプロテアーゼ

本研究では、本属プロテアーゼの中で比較的精製が容易で、かつ大量に分離が可能な蛇毒亜鉛プロテアーゼをとりあげ、このエンドプロテアーゼの構造と觸媒活性基を明らかにすることを目的としている。具体的には、このプロテアーゼの基質と阻害剤を開発し、活性部位残基を同定し、結晶のX線回析による立体構造の解明を通して、酵素活性部位のミクロ環境を明白にする。本年度は、主に基質の開発に焦点を絞って進めた。ハブ毒の出血性、非出血性の金属プロテアーゼ及びPussell's viper毒の凝固X因子活性化酵素(RVV-X)は、サーモライシンや哺乳類コラゲナーゼなどとは一次構造上相同性などのアミノ酸配列をペプチド領域内にもつ分子内蛍光消光基質(蛍光基にアミノベンゾイル基(Abz)、消光基にジニトロベンジルアミド基(Dna)をもつ)を10年合成し、その有用性を検討した。その結果、これらペプチド合成基質を用いた蛇毒金属プロテアーゼの高感度かつ簡便なアッセイ法を確立できた。フィブリノーゲン切断部位周渡配列を含むAbz-Ser-Pro-Met-Leu-Dnaは、ハブ毒出血因子(HR1A及びHR2a)によっても最も高いkcat/km値で切断されたが(切断部位はPro-Met)、サーモライシンはこの基質に対して、約1/30の活性しか示しなかった。マムシ科・クサリヘビ科の蛇の粗毒(7種)もこの基質を強く水解し、この活性はEDTAによって完全に阻害された。一方、RVV-XはP_1位にArgを好み、Abz-Gly-Phe-Arg-Leu-Leu-Dnaを最も良く水解した。また、今回開発した高感度アッセイ法により蛇毒金属プロテアーゼとサーモラシインの間、さらに出血因子とRVV-Xとの間に明白な基質特異性の差のあることが明らかとなった。

This study で は, this プ ロ テ ア ー ゼ の で more refined in easy が で, か つ large に separation が may な snake venom 亜 lead プ ロ テ ア ー ゼ を と り あ げ, こ の エ ン ド プ ロ テ ア ー ゼ の tectonic と catalytic active group を Ming ら か に す る こ と を purpose と し て い る. Specific に は, こ の プ ロ テ ア ー ゼ の matrix と resistance against tonic を open 発 し, active site residues を の X-ray back analysis with し, crystallization に よ る three-dimensional structure の interpret を tong し て, enzyme active site の ミ ク ロ environment を understand に す る. This year, the に and main に matrix <s:1> development に focus を are interwoven って into めた. Youdaoplaceholder0 poisonous poisonous hemorrhagic, non-hemorrhagic <s:1> metal プロテア ゼ ゼ ゼ and びPussell's 9 poison の coagulation factor X active phenoloxidase (RVV - X) は, サ ー モ ラ イ シ ン や mammals コ ラ ゲ ナ ー ゼ な ど と は a tectonic photogenic gay な ど の ア ミ ノ acid with column を ペ プ チ ド field に も つ intramolecular 蛍 light extinction matrix (蛍 light base に ア ミ ノ ベ ン ゾ イ ル base (Abz), extinction に ジ ニ ト ロ ベ ン ジ ル ア ミ ド base (Dna)を を を検)を10 years to synthesize を, そ <s:1> usefulness を検 to discuss た た. そ の results, こ れ ら ペ プ チ ド composite matrix を い た snake venom metal プ ロ テ ア ー ゼ の Gao Gan degrees か つ simple な ア ッ セ を イ method established で き た. フ ィ ブ リ ノ ー ゲ ン weeks cross cutting parts with column を containing む Abz - Ser - Pro - Met Leu - Dna は, ハ ブ poison bleeding factor (HR1A and び HR2a) に よ っ て も most high も い kcat/km numerical で cut さ れ た が (cut parts は Pro - Met), サ ー モ ラ イ シ ン は こ の matrix に し seaborne て, about 1/30 <s:1> active な った った shows な な った った. マ ム シ rico ク サ リ ヘ ビ secco の の thick snake poison (7) も こ の matrix を く hydrolysis し, こ の active は EDTA に よ っ て completely に resistance against さ れ た. One side, RVV-X <s:1> P_1 position にArgを is good み, Abz-Gly-Phe-Arg-Leu-Leu-Dnaを is the best く hydrolyzed た た. ま た, today back to 発 し た Gao Gan degrees ア ッ セ イ method に よ り snake venom metal プ ロ テ ア ー ゼ と サ ー モ ラ シ イ ン の, さ ら に bleeding factor と RVV -x と の に understand な substrate specificity の difference between の あ る こ と が Ming ら か と な っ た.

项目成果

武谷 浩之: "日本生化学会" 「生化学」ミニレヴュー64巻10号. 7 (1992)

竹谷宏之：《日本生物化学会》《生物化学》迷你评论第 64 卷第 10. 7 期（1992 年）

Toshiyuki Miyata: "Prothrombin Salakta:Substitution of Glutamic Acid-466 by Alaine-redces the Fibrinogen Clotting Activity and the Estarase Activety." Biochemistry. 31. 2457-7462 (1992)

Toshiyuki Miyata：“凝血酶原 Salakta：用丙氨酸替代谷氨酸 466，可降低纤维蛋白原凝血活性和 Estarase 活性。”

東 昌市: "中外医学社" Annual Review血液1992. 12 (1992)

东昌市：《中外医学社》年审血1992. 12 (1992)

Hitoshi Nishimuta: "Human Factor X Has a Tetrasaccharide O-Glycosidically Linked to Serine-61 through the Fucose Residue." 267. 17520-17525 (1992)

Hitoshi Nishimuta：“人类因子 X 具有通过岩藻糖残基与丝氨酸 61 相连的四糖 O-糖苷。”

Yoshekatsu Shigematsu: "Expression of Human Soluble Tissue factor in Yeast and Enzymatic Properties of Its Complex with Factor VIIa." 267. 21329-21337 (1992)

Yoshekatsu Shigematsu：“人类可溶性组织因子在酵母中的表达及其与因子 VIIa 的复合物的酶学特性。”