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金属プロテアーゼの構造と触媒機構の解析

金属蛋白酶的结构及催化机制分析

基本信息

批准号：
04225226
负责人：
岩永貞昭
金额：
$ 0.96万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1992
资助国家：
日本
起止时间：
1992 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では、本属プロテアーゼの中で比較的精製が容易で、かつ大量に分離が可能な蛇毒亜鉛プロテアーゼをとりあげ、このエンドプロテアーゼの構造と觸媒活性基を明らかにすることを目的としている。具体的には、このプロテアーゼの基質と阻害剤を開発し、活性部位残基を同定し、結晶のX線回析による立体構造の解明を通して、酵素活性部位のミクロ環境を明白にする。本年度は、主に基質の開発に焦点を絞って進めた。ハブ毒の出血性、非出血性の金属プロテアーゼ及びPussell's viper毒の凝固X因子活性化酵素(RVV-X)は、サーモライシンや哺乳類コラゲナーゼなどとは一次構造上相同性などのアミノ酸配列をペプチド領域内にもつ分子内蛍光消光基質(蛍光基にアミノベンゾイル基(Abz)、消光基にジニトロベンジルアミド基(Dna)をもつ)を10年合成し、その有用性を検討した。その結果、これらペプチド合成基質を用いた蛇毒金属プロテアーゼの高感度かつ簡便なアッセイ法を確立できた。フィブリノーゲン切断部位周渡配列を含むAbz-Ser-Pro-Met-Leu-Dnaは、ハブ毒出血因子(HR1A及びHR2a)によっても最も高いkcat/km値で切断されたが(切断部位はPro-Met)、サーモライシンはこの基質に対して、約1/30の活性しか示しなかった。マムシ科・クサリヘビ科の蛇の粗毒(7種)もこの基質を強く水解し、この活性はEDTAによって完全に阻害された。一方、RVV-XはP_1位にArgを好み、Abz-Gly-Phe-Arg-Leu-Leu-Dnaを最も良く水解した。また、今回開発した高感度アッセイ法により蛇毒金属プロテアーゼとサーモラシインの間、さらに出血因子とRVV-Xとの間に明白な基質特異性の差のあることが明らかとなった。

This study aims to compare the purification of this genus with that of the original genus, to make it easier to separate large quantities of snake venom, to make it easier to separate snake venom, and to make it easier to separate snake venom from its structure and catalyst active group. Specific aspects include the development of substrates and inhibitors, the identification of active site residues, the elucidation of three-dimensional structure by X-ray analysis of crystals, and the understanding of the environment of enzyme active sites. This year, the focus of the development of the main matrix has been improved. Hemorrhagic and Non-hemorrhagic Metal Species of Toxin and Pussell's Viper Toxin Coagulation Factor X Activating Enzyme (RVV-X), and Mammalian Species of Toxin and Coagulation Factor Activating Enzyme (RV-X) The 10-year synthesis and usefulness of (Abz) and (Dna) groups are discussed. As a result, a simple and sensitive method was established for the use of synthetic substrates. The highest kcat/km value of the cleavage site was found in the cleavage site cycle, which contained Abz-Ser-Pro-Met-Leu-Dna and HR1A and HR2a. The activity of the cleavage site cycle was about 1/30 of that of the substrate cycle. There are 7 kinds of crude venom in this family, which are strongly hydrolyzed and completely inhibited by EDTA. RVV-X-Arg, Abz-Gly-Phe-Arg-Leu-Dna The high sensitivity of this method is due to the difference in matrix specificity between RVV-X and RVV-X.