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リペ多糖刺激を介して血管内皮細胞で発現する組織因子の分子機能解析

脂多糖刺激血管内皮细胞表达的组织因子的分子功能分析

基本信息

批准号：
04263231
负责人：
岩永貞昭
金额：
$ 1.86万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1992
资助国家：
日本
起止时间：
1992 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

先ず従来から知られているヒト、マウスのTFの塩基配列をもとに、17mer、20merのオリゴヌクレオチドプライマー2種を作製し、ウシ副腎皮質cDNAライブラリーを鋳型にPCR反応を行ない、491bpよりなるDNA断片を得た。この断片の塩基配列より、TFのcDNAの一部であることを確認後、プローブに用い100万個のクローンをスクリーニングし、約1.6kbよりなるポジティブクローンを一個得た。このクローンの末端塩基配列を決定したところ、開始Metコドンを含み、35残基のシグナル配列に続いて、ウシTFのアミノ末端配列がコードされていた。また、これまで報告されている3種のTFは全て260残基前後よりなることから、このクローンはウシ組織因子の全領域を含むと考え、全塩基配列を決定した。その結果、ウシTFは35残基のプレ配列を含む257残基から成る糖タンパン質であり、C末端領域に23残基の膜貫通ドメイン、さらに21残基の細胞質ドメインを含むことが明らかとなった。Asn型糖鎖は残基番号8と118、146の3ケ所に存在する可能性が強く、推定分子量は32,000と算出される。さらにこのcDNAを用い、酵母での可溶性TF(rsTF)を発現を試みた。重松が可溶性ヒトTFの発現に用いた方法に従い、pAM82にウシTFの細胞外ドメイン(1-213)を挿入した発現ベクターを構築した。このベクターを用いrsTFを発現させた結果、CM-Sepharoseカラムの1ステップだけで培地1リットルあたり約2mgのrsTFを得る事ができた。このrsTFはSDS-PAGE上、38kDaの単一バンドを示し、糖鎖の付加が予想された。また、アミノ酸分析、配列分析を行ったところ、cDNAの塩基配列より予想される結果と一致した。さらに、合成基質を用いたVII因子の測定系において、rsTFは天然ウシTFとほぼ同程度の増強効果を示し、VII因子-TFの分子間相互作用の研究に活用できることがわかった。

The first one is the first one, the first one is the first one, the first one is the first one.とに、17mer、20merのオリゴヌクレオチドプライマー2 kinds of を were produced, ウシadrenal cortex cDNA ライブラリーを鋳 type PCR reaction を line ない, 491bp よりなるDNA fragment was obtained.このfragment の塩组array より, TFのcDNA の一であることをafter confirmation, プローブに用い100 Ten thousand のクローンをスクリーニングし, about 1.6kb よりなるポジティブクローンを is one.このクローンのEnd base arrangement をdetermination したところ、Start Metコドンをincludingみ、35 The residues are arranged in the residue のシグナルに続いて, and the ウシTFのアミノ terminal arrangement is がコードされていた.また、これまでreportされている3 kinds of TFは全て260 residues before and after よりなることから、このクローンはウシTissue factorの全区をcontainingむとtestえ、全婩组arrayをdeterminationした. The result of その, ウシTFは35 residues のプレarray をcontains 257 residues から into るsugar タンパンであり, C-terminal The area of 23 residues is a membrane-penetrating membrane, and the 21 residues of the field are a cytoplasmic membrane containing a clear membrane. Asn-type sugar lock residues 8 to 118, 146, 3 and 3 are highly likely to exist, and the estimated molecular weight is 32,000, and it has been calculated.さらにこのcDNA is used and yeast soluble TF (rsTF) is tested. Shigematsu's soluble TF is now used and the method is used, pAM82 is T F の extracellular ドメイン(1-213)をinsert した発existing ベクターをconstruct した.このベクターを用いrsTFを発开させたRESULTS、CM-Sepharoseカラムの1ステップだけで平地1リットルあたりabout 2mgのrsTFをgetsる事ができた.このrsTFはSDS-PAGE, 38kDa の単一バンドをshowし, sugar lock のFUKAが yu think された. The results of また, アミノ acid analysis, alignment analysis を行ったところ, and cDNA base alignment よりされる are consistent.さらに、Synthetic matrix をいたVII factor のdetermination system において、rsTF natural ウシTFとほぼ same process The degree of enhancement effect is shown, and the research on the intermolecular interaction of Factor VII-TF is put to good use.