リポ多糖刺激を介して血管内皮細胞で発現する組織因子の分子機能解析

脂多糖刺激血管内皮细胞表达的组织因子的分子功能分析

• 批准号: 05256225
• 负责人: 岩永 貞昭
• 金额: $ 1.66万
• 依托单位: Kyushu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1993
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1993 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-05256225/
• 关键词: 血液凝固組織因子; VII因子; 外因系凝固反応; VII因子-TF複合体; 酵 母; TF-リコンビナント; ウシ血液凝固因子; セリンプロテアーゼチモーゲン

外傷などに伴って組織因子が血液中に露呈されると、この因子が血血漿中のVIIa因子と分子複合体を形成しつつ、外因系凝固反応を開始する。我々は両因子間の相互作用を分子レベルで明らかにする目的で、VIIa因子上の組織因子結合部位の解析を行ない、2つの組織因子結合部位を見い出した。また、酵母を用いた発現系により、ウシ可溶性リコンビナント組織因子(rsTF,TF1-213)の大量調整に成功した。今回、このrsTFを用い、組織因子側のVIIa因子結合部位の解析を行なった。まず、VIIa-rsTF複合体による合成基質(S-2288)水解系に、ペプチドクロロメチルケトン処理によって不活化したVIIa因子、Gla-domainlesVIIa因子(VIIa(GD-))及び前駆体型VII因子を加えて拮抗阻害実験を行なった結果、不活化VIIa因子とVIIa(GD-)が強い阻害(IC_<50>=70nM)を示したのに対し、前駆体型VII因子では殆ど阻害が見られなかった(IC_<50>>900nM)。従って、rsTFはVIIa因子上の2つの組織因子結合部位のうち活性型VIIa因子に特異的に発現しているひとつを認識することが示唆された。また、この性質を利用して不溶化rsTFカラムにより、前躯体型VII因子中のきょう雑VIIa因子を特異的に除去することに成功した。一方、rsTFを、穏和な条件下トリプシン処理すると、Arg129-Ala130間のペプチド結合が切断され、切断後も約60%の活性が残存していた。そこで、両断片の分別を試みたが、1-129と130-213の断片は5M尿素存在下、分別されたものの、コファクター活性とVIIa因子結合能は共に消失した。現在、化学修飾法などを用いてVIIa因子結合部位を解析しつつある。

Trauma is associated with the formation of tissue factor in the blood, the formation of factor VIIa and molecular complexes in the blood plasma, and the onset of coagulation reaction caused by external factors. The interaction between factors is known as the molecular structure, the tissue factor binding site on factor VIIa is analyzed, and the tissue factor binding site on factor VIIa is analyzed. It has been successfully used in the production of yeast and yeast, and it has been successfully adjusted in large quantities using the soluble Ryokon tissue factor (rsTF, TF1-213). This time, the use of rsTF and the analysis of the factor VIIa binding site on the tissue factor side are analyzed.まず, VIIa-rsTF complex synthetic matrix (S-2288) hydrolysis system に, ペプチドクロロメチルケトン treatment によってInactivated したVIIa factor, Gla-domainlesVIIa factor (VIIa(GD-)) and びfront-shaped type VII Factor を plus え て antagonistic block 実験 を row な っ た result, inactivated factor VIIa とVIIa (GD-) strong い block (IC_<50>= 70nM) したのに対し, former 槆 type VII factor では殆どblocking られなかった (IC_<50>>900nM).従って, rsTF and はVIIa factor on the の2つのtissue factor binding site のうちactive type factor VIIa にspecific に発appears しているひとつをknow することが Show唆された. The properties of また and このをUse the して to insolubilize rsTF カラムにより, and the のきょう雑VIIa factor を in the precursor type VII factor, and successfully remove the することに. On the one hand, under the conditions of rsTF, トリプシン treatment, and Arg129-Ala130, the combination of のペプチド is cut off, and about 60% of the activity remains after cutting.そこで, 両 fragments are separated, みたが, 1-129 and 130-213 fragments are stored in 5M urea Below, respectively, されたものの, コファクターactive and factor VIIa binding energy はKOにdisappearanceした. Currently, the chemical modification method is analyzed using the factor VIIa binding site analysis method.

项目成果

Fuminori Tokunaga: "Limulus Hemocyte Transglutaminase: Its Purification and Characterization,and Identification of the Intracellular Substrates." J. Biol. Chem.268. 252-261 (1993)

Fuminori Tokunaga：“鲎血细胞转谷氨酰胺酶：其纯化和表征，以及细胞内底物的鉴定。”

Shun-ichiro Kawabata: "Rebbit Liver Microsomal Endopeptidase with Substrate Specificity for processing proproteins is Structurally Related to Rat Tests Metalloendopeptidase 24.15." J.Biol. Chem.268(17). 12498-12503 (1993)

Shun-ichiro Kawabata：“具有处理原蛋白底物特异性的 Rebbit 肝微粒体内肽酶在结构上与大鼠测试金属内肽酶 24.15 相关。”

Fuminori Tokunaga: "Limulus Hemocyte Transglutaminase: cDNA Cloning, Amino Acid Sequence, and Tissue Localization." J. Biol. Chem.268. 262-268 (1993)

Fuminori Tokunaga：“鲎血细胞转谷氨酰胺酶：cDNA 克隆、氨基酸序列和组织定位。”

西村 仁: "糖鎖の多様な世界" 講談社サイエンティフィク, 16 (1993)

西村仁：“糖链的多样化世界”讲谈社科学，16（1993）

Sadaaki Iwanaga: "Intracellular LPS-binding Proteins and Peptides Found in Limulus Hemocytes." Proceedings of the 2nd Conference of the International Endotoxin Society(Ed.by J. Levin,et al.). 185-192 (1993)

Sadaaki Iwanaga：“在鲎血细胞中发现细胞内 LPS 结合蛋白和肽。”