血小板中の新しい細胞増殖抑制因子とその調節タンパク質の遺伝子クロ-ニング

ラット血小板から純化したmasking proteinを用い、110kDサブユニットの部分アミノ酸配列を決定した。4ヶ所のペプチドフラグメントのアミノ酸配列を基にして合成したオリゴヌクレオチドをプロ-ブとしてラット巨核球のcDNAライブラリ-をスクリ-ニングした。その結果、5個のcDNAクロ-ンが得られ、そのうち最長の5kbのクロ-ンを用い、Northern blot analysisを行ったところ110kDサブユニットのmRNAのサイズは6kbであることが明かとなった。5kbのcDNAの塩基配列を決定したところ、4.2kbのopen reading frameを含み、この中には上記4種類のペプチドフラグメントのアミノ酸配列全てを含んでいた。mRNAのサイズからこのクロ-ンの上流には約1kbほどの配列が欠けていると考えられるので、5'ー上流1kbをカバ-するcDNAを得るためprimer extended cDNA libraryをスクリ-ニングした。結果として110kDサブユニットのmRNA 6kbに対応する全てのcDNAクロ-ンを単離した。110kDサブユニットのmRNAは約5kbの長いopen reading frameを持ち、アミノ酸数にして約1700残基の大きな前駆タンパク質をコ-ドしている。成熟型の110kDサブユニットは前駆タンパク質の約600残基目からC末端側に位置し、841残基のアミノ酸からなる。N末端側にはHisーArgーArgーArg、C末端側にはGlyーArgーArgーArgの配列からなるプロセッシングサイトがあり、ある種のセリンプロテア-ゼで切断され、成熟110kDサブユニット分子中にはEGF like domainが13個繰り返して並んでおり、またshort consensus repeatと類似した新しいinternal repeatを2個含んでいるなど実にユニ-クな構造であることが明らかとなった。

ラット血小板から純化したmasking proteinを用い、110kDサブユニットの部分アミノ酸配列を決定した。4ヶ所のペプチドフラグメントのアミノ酸配列を基にして合成したオリゴヌクレオチドをプロ-ブとしてラット巨核球のcDNAライブラリ-をスクリ-ニングした。その結果、5個のcDNAクロ-ンが得られ、そのうち最長の5kbのクロ-ンを用い、Northern blot analysisを行ったところ110kDサブユニットのmRNAのサイズは6kbであることが明かとなった。5kbのcDNAの塩基配列を決定したところ、4.2kbのopen reading frameを含み、この中には上記4種類のペプチドフラグメントのアミノ酸配列全てを含んでいた。mRNAのサイズからこのクロ-ンの上流には約1kbほどの配列が欠けていると考えられるので、5'ー上流1kbをカバ-するcDNAを得るためprimer extended cDNA libraryをスクリ-ニングした。結果として110kDサブユニットのmRNA 6kbに対応する全てのcDNAクロ-ンを単離した。110kDサブユニットのmRNAは約5kbの長いopen reading frameを持ち、アミノ酸数にして約1700残基の大きな前駆タンパク質をコ-ドしている。成熟型の110kDサブユニットは前駆タンパク質の約600残基目からC末端側に位置し、841残基のアミノ酸からなる。N末端側にはHisーArgーArgーArg、C末端側にはGlyーArgーArgーArgの配列からなるプロセッシングサイトがあり、ある種のセリンプロテア-ゼで切断され、成熟110kDサブユニット分子中にはEGF like domainが13個繰り返して並んでおり、またshort consensus repeatと類似した新しいinternal repeatを2個含んでいるなど実にユニ-クな構造であることが明らかとなった。