B細胞抗原受容体を介した細胞内情報伝達と免疫寛容の分子機構

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1.抗原受容体刺激直後にチロシリン酸化される主要な基質として、転写因子様配列、核移行シグナル様の配列、ならびにSH3配列を有する蛋白質p75^<HS1>を固定した。p75^<HS1>は渡辺らが樹立したHS1欠損マウスの解析から、Bリンパ球のApoptosisに関わることが明らかとなっており、そのリン酸化機構を解析することは重要である。そこで、B細胞抗体受容体に会合するLynやSykをp75^<HS1>と共にCV1細胞で高発現させた。その結果p75^<HS1>のリン酸化は、LynあるいはSyk単独では殆ど起こらず、LynとSyk共存下で、起こることが明らかとなった。そしてp75^<HS1>の2つのチロシン残基(Y378とY397)が、これらキナーゼによってリン酸化される部位であることを、Y378FならびにY397F変異体や両チロシン残基を含む配列を欠失する変異体を作成することによって示した。更に、CVI細胞での高発現系を用いて、リン酸化に伴うp75^<HS1>の局在の変化を調べ、非リン酸化状態のp75^<HS1>が細胞質に局在するのに対し、LynとSykの協調によりリン酸化されたp75^<HS1>は核に移行しうることを示した。従ってB細胞に於て抗原受容対刺激に伴い、p75^<HS1>はチロシンリン酸化され、少なくともその一部は核に移行して、Apoptosis等の生理機能に関与すると考えられる。2.lyn遺伝子欠損マウス樹立のためにゲノム解析のlyn遺伝子の単離を試み、その過程でlyn遺伝子が少なくとも2コピー存在することを明らかにした。hnRNAを鋳型としたRT-PCR法、およびそれぞれのコピーのエクソンの塩基配列とcDNAの塩基配列の比較により、このうちの一つが転写される機能lyn遺伝子であることを示した。次いで機能lyn遺伝子のエクソン3にneo遺伝子を組み込んだターゲティングベクターを構築し、ES細胞内での相同組み換えを経て、lyn遺伝子をホモに欠損するマウスを作成した。得られたlyn遺伝子欠損マウスは、外見上の発達成育及び行動に特に異常を呈していない。脾臓B細胞ではsIgM架橋による細胞内蛋白質のチロシンリン酸化に著しい減弱が見られた。今後更に、B細胞の増殖能、Apoptosisi反応等についてlyn欠損マウスを用いて解析を行う予定である。