DNA除去修復における色素性乾皮症蛋白の相互作用の解析

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1.XPA蛋白質のDNA結合ドメインの同定障害DNA特異的結合活性を有するXPA蛋白質を、キモトリプシンにより限定分解後、サウスウエスタン法により障害DNAに結合する2つのポリペプチドを検出した。それらのポリペプチドを精製しN末端のアミノ酸配列を決定すると、2つとも同一のN末端を有していた。その情報をもとに種々の組換え短縮蛋白質を作製し、122アミノ酸よりなるDNA結合ドメイン(MF122)を同定した。MF122はZnフィンガーモチーフを含み、UV照射DNAのみならずシスプラチン処理した障害DNAにも結合した。また、MF122は円偏光二色性分析よりヘリックスに富み二次構造を持つことがわかった。2.既知の除去修復関連蛋白質間の相互作用組換え蛋白質や抗体を用いた生化学的な方法や酵母two-hybrid systemにより、XPA蛋白質とERCC1蛋白質ならびに単鎖DNA結合蛋白質(RPA/HSSB)が結合することを示した。ERCC1蛋白質との結合には、XPAホモローグ間で種を越えて保存されているEクラスター領域が必要であった。上記のMF122はERCC1蛋白質とは結合せず、XPA蛋白質のDNA結合ドメインとERCC1結合領域を分離することができた。また、XPA蛋白質はERCC1蛋白質と結合することにより単独の場合に比べよりよく障害DNAへ結合することもわかった。3.XPA蛋白質と結合する新規蛋白質のcDNAクローニング酵母two-hybrid systemを用い、HeLe細胞由来cDNAライブラリーをスクリーニングすることにより、XPA蛋白質と結合する蛋白質のcDNAとして39のポジティブクローンを単離した。これらは、2種類のグループに分類でき、このうち1種類はRPAの34kDaのサブユニットをコードしていたが、他の2種類は新規の蛋白質をコードしていた。更に、別のライブラリーを用いたスクリーニングも進行している。